3.4: Introducir ADN recombinante en células hospedadoras
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E. coli no tiene un sistema natural para tomar ADN, pero cuando se trata con\(\ce{CaCl2}\), las células tomarán el ADN agregado (Figura\(\PageIndex{1}\)). Los vectores recombinantes darán un nuevo fenotipo a las células (generalmente farmacorresistencia), por lo que este proceso puede considerarse transformación mediada por ADN. Una eficiencia promedio es de aproximadamente 10 6 transformantes por mg de ADN, aunque algunos procedimientos de cocteles de transformación más elaborados pueden dar hasta aproximadamente 10 8 transformantes por mg de ADN.
Por lo general, se transformará con una mezcla de moléculas vectoriales recombinantes, la mayoría de las cuales portan un fragmento de restricción diferente. Cada célula de E. coli transformada recogerá solo una molécula plasmídico, por lo que la mezcla compleja de plásmidos en la mezcla de ligación se ha separado en una población de bacterias transformadas (Figre\(\PageIndex{1}\)). Las células bacterianas son luego sembradas a una densidad suficientemente baja para que puedan identificarse colonias individuales. Cada colonia (o transformante) lleva un solo plásmido, así como uno criba las colonias, en realidad se está cribando a través de moléculas de ADN individuales. Una colonia es un grupo visible de células bacterianas en una placa, todas las cuales se derivan de una sola célula bacteriana. Un grupo de células idénticas derivadas de una sola célula se llama clon. Dado que cada clon lleva un solo tipo de molécula de ADN recombinante, el proceso se denomina clonación molecular.
Vectores de fagos
Los vectores de fase son una introducción más eficiente de ADN en bacterias. Los vectores de fagos como los derivados del bacteriófago l pueden portar insertos más grandes y pueden introducirse en bacterias de manera más eficiente. El fago tiene un genoma de ADN dúplex de aproximadamente 50 kb. Los 20 kb internos pueden ser reemplazados por ADN foráneo y aún conservan las funciones líticas. Por lo tanto, los fragmentos de restricción de hasta 20 kb pueden reemplazar las secuencias l, permitiendo clonar fragmentos de ADN genómico más grandes (Figura\(\PageIndex{2}\)).
El bacteriófago recombinante puede ser introducción en E. coli por infección. El ADN que tiene los extremos cohesivos de l se puede empaquetar in vitro en partículas de fago infeccioso. Estar en una partícula viral aporta la eficiencia de la infección de manera confiable sobre 108 unidades formadoras de placa por mg de ADN recombinante.
Algunos otros vectores bacterifagos para la clonación se derivan del virus M13. Se puede obtener ADN monocatenario a partir de vectores M13 y recombinantes. M13 es un virus con un genoma de ADN monocatenario. Tiene una región no esencial en la que se pueden insertar genes extraños. Se ha modificado para portar un gen para b -galactosidasa como una forma de cribar recombinantes. La introducción de ADN M13 recombinante en E. coli conducirá a una infección del huésped, y las partículas virales de la progenie contendrán ADN monocatenario. La forma replicativa es dúplex, lo que permite escindir con enzimas de restricción e insertar ADN extraño.
Algunos vectores son híbridos entre plásmidos y fagos monocatenarios; estos se denominan fagémidos. Un ejemplo es pBluescript. Los fagémidos son plásmidos (con el origen modificado de alto número de copias ColE1) que también tienen un origen de replicación M13. La infección de bacterias transformadas (que contienen el fagémido) con un virus auxiliar (por ejemplo, derivado de M13) provocará que se active el origen M13, y se pueden obtener virus de la progenie que portan copias monocatenarias del fagémido. Por lo tanto, se pueden obtener fácilmente formas bicatenarias o monocatenarias de estos plásmidos. {El “azul” proviene del cribado blanco-azul para recombinantes que se puede hacer cuando los múltiples sitios de clonación están en el gen de la b‑galactosidasa. El “script” se refiere a la capacidad de hacer copias de ARN de cualquiera de las cadenas in vitro con polimerasas de ARN de fagos.}
Vectores diseñados para llevar insertos más grandes
Fragmentos incluso mayores que los transportados en vectores l son útiles para estudios de segmentos más largos de cromosomas o genomas completos. Se han diseñado varios vectores para clonar estos fragmentos muy grandes, de 50 a 400 kb.
- Los cósmidos son plásmidos que tienen los extremos cohesivos del fago l. Se pueden empaquetar in vitro en partículas de fagos infecciosos para proporcionar una administración más eficiente del ADN en las células. Pueden llevar unos insertos de 35 a 45 kb.
- Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) son vectores de levadura con centromeros y telómeros. Pueden portar alrededor de 200 kb o fragmentos más grandes (en principio hasta 1000 kb = 1 Mb). Así, fragmentos muy grandes de ADN pueden clonarse en levaduras (Figura\(\PageIndex{3}\)). En la práctica, los clones quiméricos con fragmentos de diferentes regiones del genoma se obtienen con bastante frecuencia, y algunos de los insertos son inestables.
,Los vectores derivados del bacteriófago P1 pueden portar fragmentos de aproximadamente 100 kb. Los fragmentos en un rango de tamaño similar también se clonan en cromosomas artificiales bacterianos (BAC), los cuales se derivan del factor F (Figura\(\PageIndex{4}\)). Estos tienen un número de copias menor (como F) pero son estables y relativamente fáciles de trabajar en el laboratorio. Los BAC se han convertido en uno de los vectores más utilizados para grandes insertos en proyectos genómicos.
Vectores lanzadera para probar funciones de genes aislados
Los vectores lanzadera pueden replicarse en dos organismos diferentes, por ejemplo bacterias y levaduras, o células y bacterias de mamíferos. Tienen los orígenes apropiados de replicación. De ahí que uno pueda, por ejemplo clonar un gen en bacterias, tal vez modificarlo o mutarlo en bacterias, y probar su función introduciéndolo en levaduras o células animales.