6.E: Replicación del ADN II: Inicio, parada y control (Ejercicios)

6.12

¿En qué etapa se regula la velocidad de replicación del ADN en E. coli: iniciación, elongación o terminación?

6.13

El siguiente problema ilustra adicionalmente el análisis de replicación mediante marcaje de pulsos, utilizando un virus hipotético y datos construidos. Considerar la replicación de un ADN viral circular en células infectadas. Las células infectadas se marcaron por pulsos con [3H] timidina durante 1, 2, 3 y 4 min; las moléculas de ADN tardan 4 minutos en replicarse en este sistema (desde el inicio hasta la terminación). Aquellas moléculas de ADN que habían completado la síntesis en cada momento fueron aisladas, cortadas con una endonucleasa de restricción y ensayadas para determinar la radiactividad en cada fragmento. Esta endonucleasa de restricción escinde el ADN circular en 6 fragmentos, denominados A, B, C, D, E y F en una orientación hacia la derecha alrededor del genoma. Se obtuvieron los siguientes resultados; un plus (+) significa que el fragmento fue marcado radiactivamente, y un menos (-) significa que no fue marcado.

Fragmento	Tiempo de etiquetado (min)
	1	2	3	4
A	-	-	+	+
B	-	-	-	+
C	-	-	+	+
D	-	+	+	+
E	+	+	+	+
F	-	+	+	+

1. ¿Qué fragmento de restricción tiene el origen y cuál tiene el término de replicación?
2. ¿En qué dirección (es) se replica este ADN viral?

6.14

Los geles bidimensionales desarrollados por Brewer y Fangman se utilizaron para examinar el origen de replicación de una molécula de ADN. En este sistema, las moléculas replicantes se escinden con una endonucleasa de restricción y se separan en dos dimensiones. La primera dimensión se separa en función del tamaño, y la segunda se separa en base a la forma (las desviaciones más pronunciadas de la linealidad se mueven más lentamente en la segunda dimensión). Después de aplicar el ADN a una membrana, se sondea con fragmentos del replicón en estudio. El fragmento de restricción P da el patrón mostrado a la izquierda, y el fragmento adyacente Q da el patrón mostrado a la derecha. La línea punteada denota la diagonal esperada si todas las moléculas fueron lineales. Suponiendo que tanto P como Q están en el mismo replicón, ¿qué se puede concluir sobre las posiciones de los orígenes de replicación?

6.15

El Dr. Howard Cedar y sus colegas de la Universidad Hebrea de Jerusalén han desarrollado un ensayo de dirección de replicación para mapear los orígenes de replicación en cromosomas (Kitsberg et al., Nature 366:588-590, 1993). Las células en crecimiento se tratan con el fármaco emetina para inhibir la síntesis de cadenas rezagadas. La síntesis de la cadena principal continúa, y este ADN recién sintetizado se marca por densidad mediante la incorporación de 5-bromodeoxiuridilato (se agrega 5-bromodeoxiuridina al medio). Luego, el ADN se corta y desnaturaliza, y el ADN de la cadena principal recién sintetizado se separa del resto del ADN por equilibrio de sedimentación en gradientes de Cs2SO4. Muestras del ADN de densidad pesada (que contiene 5-bromodeoxiuridilato) se manchan sobre una membrana, y cantidades iguales se hibridan con cadenas marcadas separadas de fragmentos de restricción a lo largo de una región.

El uso de este enfoque para mapear los orígenes de replicación en el grupo génico de globina similar a b humana condujo a resultados como los siguientes. Los nombres de los genes se dan encima de la línea, y los nombres de los fragmentos de restricción se dan debajo de la línea. A + significa que la cadena principal (con 5-bromodeoxiuridilato incorporado) hibridó preferentemente con una sonda marcada correspondiente a la cadena designada, mientras que a - significa que el ADN de la cadena principal no hibridó con la sonda designada. Los genes se transcriben de izquierda a derecha en este diagrama, por lo que la cadena “superior” lee lo mismo que el ARNm en las regiones codificantes (nuestra convención es “no plantilla”) y la cadena “inferior” (abreviada “bot”) es complementaria a la cadena superior (cadena “molde” o cadena “antisentido”).

e Gg Ag yh d b

|_|_ —> _|____|_ —> _|_ —> _|____|__ —> _|___|_ —> _|___|__|_ —> _|____|

A B C D E F G H I J K L M

+ + + + + + + + + + + - - arriba

- - - - - - - - - - + + bot

1. ¿Cuál (s) fragmento (s) de restricción contiene (n) el origen de la replicación?
2. ¿La replicación de este origen es unidireccional o bidireccional?
3. Explica cómo los datos te llevaron a tus respuestas a a y b.
4. ¿En qué dirección se mueve la bifurcación de replicación para los fragmentos A a K?
5. ¿En qué dirección se mueve la horquilla de replicación para los fragmentos L y M?
6. Nombra una posible enzima diana que pueda bloquear específicamente la síntesis de cadenas rezagadas cuando se inhiba.
7. ¿Qué vector de clonación sería útil para generar las cadenas separadas de los fragmentos de restricción?

6.16

Imaginemos que has aislado un nuevo virus con un ADN circular bicatenario que tiene 6000 pb de largo. La endonucleasa de restricción Hha I escinde el ADN como se muestra a continuación para generar 6 fragmentos.

Inicialmente se utiliza un procedimiento de etiquetado de pulsos para mapear el origen y el término de la replicación. Las células infectadas primero se dejaron incorporar [32P] fosfato en el ADN durante varias horas para marcar uniformemente el ADN, y luego se añadió [3H] timidina por periodos cortos de tiempo (marcadores de pulso), es decir, 5, 10 y 15 min. Se aislaron moléculas de ADN viral completas, se cortaron con Hha I y se separaron en geles de poliacrilamida. La cantidad de [32P] y [3H] en cada fragmento se determinó para cada periodo de marcador de pulso y se tabula a continuación. Los datos se corrigen para el contenido de timidina y se normalizan para que el fragmento A tenga una relación de 1.

Cantidad relativa de etiqueta de pulso

Fragmento	5 min	10 min	15 min
A	1.0	1.0	1.0
B	0.5	0.7	1.0
C	0	0.5	0.8
D	5.0	4.1	2.3
E	4.2	3.2	1.7
F	2.9	2.1	1.4

1. ¿Cuál (s) fragmento (s) de Hha I contiene (n) el origen y el término de la replicación?
2. ¿Cuál es el modo (uni- o bidireccional, u otro) y la (s) dirección (es) de replicación (es decir, en sentido horario y/o antihorario)?
3. Para confirmar este resultado y mapear el origen y el término con mayor precisión, se analizaron los intermedios replicativos en geles bidimensionales. El ADN de las células infectadas, que contenía ADN virales en todas las etapas de la síntesis, se digirió con Hha I y luego se ejecutó inicialmente en un gel que se separa en base al tamaño y luego en dirección perpendicular en un gel que acentúa las separaciones basadas en la forma (geles Brewer y Fangman). El ADN en el gel se traspasó a una membrana de nylon y se hibridó con sondas radiomarcadas para los fragmentos de ADN viral. Se muestran los patrones de hibridación obtenidos para los fragmentos A, C y D de Hha I. La línea hipotética para intermedios lineales de un fragmento que se expande de longitud unitaria a dos veces unidad de longitud se proporciona como guía. ¿Cómo interpretas estos datos y qué aprendes sobre el origen y el término? Indique el significado de cualquier transición en los patrones.

4. (d) También utilizó un ensayo de dirección de replicación para examinar el origen de la replicación. Las células infectadas por virus se trataron con el fármaco emetina para inhibir la síntesis de cadenas rezagadas. La síntesis de la cadena principal continuó durante el tratamiento farmacológico, y este ADN recién sintetizado fue marcado por densidad mediante la incorporación de 5-bromodeoxiuridilato (se agrega 5-bromodesoxiuridina al medio). El ADN fue cortado y desnaturalizado, y el ADN de cadena principal recién sintetizado se separó del resto del ADN por equilibrio de sedimentación en gradientes de Cs2SO4. Se colocaron muestras del ADN de densidad pesada (que contenía 5-bromodeoxiuridilato) sobre una membrana, y se hibridaron cantidades iguales a cadenas separadas y marcadas de fragmentos de restricción a lo largo del virus. Para realizar un seguimiento de las hebras y la orientación en este problema, imaginemos que el círculo dúplex tiene una hebra externa orientada 5' a 3' en sentido horario y una hebra interna orientada 5' a 3' en sentido contrario a las agujas del reloj, como se esquematiza a continuación.

A continuación se muestra una cuadrícula de muestras de ADN de densidad pesada (que contienen 5-bromodeoxiuridilato y enriquecidas para ADN de cadena principal) inmovilizadas en el filtro, representando cada rectángulo una carga igual del ADN de densidad pesada. ¿Cuál será el patrón de hibridación a las hebras indicadas de cada uno de los fragmentos de restricción?

¿Qué le dice este experimento sobre el origen y el término de la replicación?

6.17

¿Son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones sobre la función de la proteína DNAA?

1. La proteína DNAA se une a repeticiones de 9 meros (nonámeros) en el origen para la replicación cromosómica.
2. La proteína DNAA cataliza la formación de los cebadores para la síntesis de la cadena líder en el origen.
3. Alrededor de 20 a 40 monómeros de la proteína DNAA forman un gran complejo en su origen.
4. La proteína DNAA funde el ADN en una serie de repeticiones de 13 meros en el origen.

6.18

Considere una bacteria con un cromosoma circular con un origen de replicación. Se necesitan 30 min para que la replicación bidireccional copie su cromosoma (el tiempo de elongación o periodo C) y 10 min desde el final de la síntesis de ADN hasta que la célula se divida (el periodo D). ¿Cuántas horquillas de replicación se necesitan por cromosoma para permitir que un cultivo de esta bacteria se duplique en número de células cada 20 min? Siga las moléculas a través de un ciclo completo de división celular.

6.19

En muchos eucariotas, los genes transcritos activamente se replican temprano en la fase S y los genes inactivos se replican tarde. Un ensayo para determinar el tiempo de replicación es la hibridación in situ de células con una sonda fluorescente específica del gen, seguida del examen del número de señales por núcleo. En las células diploides, un gen no replicado se verá como 2 puntos fluorescentes por núcleo, mientras que un gen replicado se verá como 4 puntos. Parecen 2 dobletes, lo que indica que las cromátidas replicadas están cerca en el núcleo.

A continuación se muestran los tipos de patrón que se pueden ver en diversas etapas del ciclo celular. Cada punto oscuro es una señal fluorescente, el círculo más grande es la célula y el círculo más pequeño es el núcleo.

Luego se tabula la fracción de células en una población asíncrona con 2 puntos o 4 puntos. En una población asíncrona, el número de células en cada fase del ciclo celular es directamente proporcional a la duración de esa fase. Si GENEA se replicara 1 hr después de la entrada a la fase S, y GENEB se replicara 1 hr antes del final de la fase S, ¿qué fracción de células mostraría 4 puntos (dos dobletes) para cada uno? La longitud de cada fase del ciclo celular se da en la figura, y la punta de flecha vertical muestra el tiempo de síntesis. El tiempo desde la síntesis de cada gen hasta el inicio de G2 se muestra por encima de una línea horizontal. Considera que las celdas en M tienen 4 puntos (es decir, supongamos que la transición de 4 puntos a 2 ocurre en el límite M a G1).

Colaboradores y Atribuciones

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