7.4: Mecanismos de Reparación

La segunda parte de este capítulo examina las principales clases de procesos de reparación del ADN. Estos son:

• reversión del daño,
• reparación por escisión de nucleótidos,
• reparación por escisión de base,
• reparación de desajuste,
• reparación recombinacional, y
• reparación propensa a errores.

Muchos de estos procesos fueron primeros estudios en bacterias como E. coli, sin embargo solo unos pocos se limitan a esta especie. Por ejemplo, la reparación por escisión de nucleótidos y la reparación por escisión de bases se encuentran en prácticamente todos los organismos, y se han caracterizado bien en bacterias, levaduras y mamíferos. Al igual que la replicación del ADN en sí, la reparación del daño y la incorporación errónea es un proceso muy antiguo.

Reversión de daños

Algunos tipos de alteración covalente a bases en el ADN pueden revertirse directamente. Esto ocurre por sistemas enzimáticos específicos que reconocen la base alterada y rompen enlaces para eliminar el aducto o cambiar la base de nuevo a su estructura normal.

La fotorreactivación es un proceso dependiente de la luz utilizado por las bacterias para revertir los dímeros de pirimidina formados por radiación UV. La enzima fotoliasa se une a un dímero de pirimidina y cataliza una segunda reacción fotoquímica (esta vez usando luz visible) que rompe el anillo de ciclobutano y reforma los dos timidilatos adyacentes en el ADN. Obsérvese que esto no es formalmente lo contrario de la reacción que formó los dímeros de pirimidina, ya que la energía de la luz visible se utiliza para romper los enlaces entre las pirimidinas, y no se libera radiación UV. Sin embargo, el resultado es que la estructura del ADN ha sido devuelta a su estado previo al daño por UV. La enzima fotoliasa tiene dos subunidades, las cuales son codificadas por los genes phrA y phrB en E. coli.

Un segundo ejemplo de la inversión del daño es la eliminación de grupos metilo. Por ejemplo, la enzima O6-metilguanina metiltransferasa, codificada por el gen ada en E. coli, reconoce O6-metilguanina en el ADN dúplex. Luego elimina el grupo metilo, transfiriéndolo a un aminoácido de la enzima. La enzima metilada ya no está activa, de ahí que a esto se le haya referido como un mecanismo suicida para la enzima.

Reparación de Escisión

El medio más común para reparar el daño o un desapareamiento es cortarlo del ADN dúplex y recopiar la hebra complementaria restante del ADN, como se indica en la Figura 7.12. Se han caracterizado tres tipos diferentes de reparación por escisión: reparación por escisión de nucleótidos, reparación por escisión de bases y reparación de desapareamientos. Todos utilizan un mecanismo de corte, copia y pegado. En la etapa de corte, una enzima o complejo elimina una base dañada o una cadena de nucleótidos del ADN. Para la copia, una ADN polimerasa (ADN polimerasa I en E. coli) copiará la plantilla para reemplazar la hebra escindida y dañada. La ADN polimerasa puede iniciar la síntesis a partir de OH 3' a la rotura monocatenaria (mella) o brecha en el ADN que queda en el sitio de daño después de la escisión. Finalmente, en la etapa de pegado, la ADN ligasa sella la mella restante para dar un ADN intacto y reparado.

Figura 7.12. Un esquema general para la reparación de la escisión, que ilustra el mecanismo de corte (pasos 1 y 2), copia (paso 3) y pasta (paso 4).

Reparación de Escisión de Nucleótidos (NER)

En la reparación por escisión de nucleótidos, las bases dañadas se cortan dentro de una cadena de nucleótidos y se reemplazan con ADN como lo indica la cadena molde no dañada. Este sistema de reparación se utiliza para eliminar dímeros de pirimidina formados por radiación UV así como nucleótidos modificados por aductos químicos voluminosos. La característica común del daño que se repara por escisión de nucleótidos es que los nucleótidos modificados causan una distorsión significativa en la hélice del ADN. La NER se presenta en casi todos los organismos examinados.

Algunas de las enzimas mejor caracterizadas que catalizan este proceso son la excinucleasa uvRABC y la helicasa UvrD en E. coli. Los genes que codifican esta función reparadora fueron descubiertos como mutantes altamente sensibles al daño UV, lo que indica que los mutantes son defectuosos en la reparación UV. Como se ilustra en la Figura 7.13, las células de E. coli de tipo silvestre se destruyen solo a dosis más altas de radiación UV. Se pueden identificar cepas mutantes que son sustancialmente más sensibles a la radiación UV; estas son defectuosas en las funciones necesarias para la resistencia UV, abreviada uvr. Al recolectar un gran número de dichos mutantes y analizarlos para determinar su capacidad para restaurar la resistencia a la radiación UV en combinación, se identificaron grupos de complementación. Cuatro de los grupos de complementación, o genes, codifican proteínas que juegan reglas principales en la NER; son uvrA, UvrB, UvrC y UvrD.

Figura 7.13. Curva de supervivencia de bacterias expuestas a radiación UV. Los cultivos de bacterias se exponen a dosis crecientes de radiación UV, trazadas a lo largo del eje horizontal. Luego se colocan muestras de cada cultivo irradiado y se cuenta el número de colonias supervivientes (graficadas como una función logarítmica en el eje vertical). Las cepas mutantes que son más sensibles al daño UV son defectuosas en los genes que confieren resistencia UV - r, es decir, son defectuosas en las funciones uvr.

Las enzimas codificadas por los genes uvr han sido estudiadas en detalle. Los productos polipeptídicos de los genes uvrA, uvrB y uvrC son subunidades de una enzima multisubunidad llamada excinucleasa uvRab. UvrA es la proteína codificada por UvrA, UvrB está codificada por UvrB, y así sucesivamente. El complejo UVrabC reconoce distorsiones estructurales inducidas por daños en el ADN, como los dímeros de pirimidina. Luego se escinde en ambos lados del daño. Después UvrD (también llamada helicasa II), el producto del gen uvRD, desenrolla el ADN, liberando el segmento dañado. Así, para este sistema, las proteínas uvRABC y UvrD llevan a cabo una serie de etapas en la fase de corte de reparación por escisión. Esto deja un sustrato separado para copiar por ADN polimerasa y pegar por ADN ligasa.

Las proteínas UVrabC forman un complejo dinámico que reconoce el daño y realiza cortes endonucleolíticos en ambos lados. Los dos cortes alrededor del daño permiten que el segmento monocatenario que contiene el daño sea escindido por la actividad helicasa de UvRD. Así, el complejo dinámico UvrBC y el complejo UvrBC se pueden llamar excinucleasas. Después de que el segmento dañado ha sido extirpado, queda un hueco de 12 a 13 nucleótidos en el ADN. Esto puede ser rellenado por ADN polimerasa y la mella restante sellada por ADN ligasa. Dado que el molde no dañado dirige la síntesis por la ADN polimerasa, el ADN dúplex resultante ya no se daña.

Con más detalle, el proceso va de la siguiente manera (Figura 7.14). UvrA ₂ (un dímero) y Uvr B reconocen el sitio dañado como un complejo (UvrA) 2UvrB. UvRa ₂ luego se disocia, en un paso que requiere hidrólisis de ATP. Esta es una reacción autocatalítica, ya que es catalizada por UvrA, que es en sí misma una ATPasa. Después de que UvrA se ha disociado, UvrB (en el sitio dañado) forma un complejo con UvrC. El complejo UvrBC es la nucleasa activa. Realiza las incisiones en cada lado del daño, en otro paso que requiere ATP. El esqueleto fosfodiéster se escinde 8 nucleótidos al lado 5' del daño y 4-5 nucleótidos en el lado 3'. Finalmente, la helicasa UvrD luego desenrolla el ADN para que se elimine el segmento dañado. El segmento de ADN dañado se disocia unido al complejo UvrBC. Como todas las reacciones de helicasa, el desenrollado requiere hidrólisis de ATP para interrumpir los pares de bases. Por lo tanto, se requiere hidrólisis de ATP en tres etapas de esta serie de reacciones.

Figura 7.14.La excinucleasa Uvr (A) BC de E. coli reconoce sitios AP, dímeros de timina y otras distorsiones estructurales y produce mellas en ambos lados de la región dañada. El fragmento de 12-13 nucleótidos de longitud se libera junto con la excinucleasa por acción helicasa II.

Ejercicio 7.9

¿En qué se diferencia una excinucleasa de una exonucleasa y una endonucleasa?

La reparación por escisión de nucleótidos es muy activa en células de mamíferos, así como en células de otros organismos. ¡El ADN de una célula cutánea normal expuesta a la luz solar acumularía miles de dímeros por día si este proceso de reparación no los eliminara! Una enfermedad genética humana, llamada xerodermia pigmentosa (XP), es una enfermedad de la piel causada por defecto en enzimas que eliminan lesiones UV. Los fibroblastos aislados de pacientes con XP individuales son marcadamente sensibles a la radiación UV cuando se cultivan en cultivo, similar al fenotipo mostrado por los mutantes de E. coli uvr. Estas líneas celulares XP se pueden fusionar en cultivo y probar la capacidad de restaurar la resistencia al daño UV. Las líneas celulares XP que lo hacen caen en diferentes grupos de complementación. De esta manera se han definido varios grupos de complementación, o genes. Recientemente se ha avanzado considerablemente en la identificación de las proteínas codificadas por cada gen XP (Cuadro 7.2). Tenga en cuenta la estrecha analogía con las funciones bacterianas necesarias para la NER. Funciones similares también se encuentran en levaduras (Cuadro 7.2). Las proteínas adicionales utilizadas en la NER eucariota incluyen HHR23b (que forma un complejo con el sensor de daño al ADN XPC), ERCCI (que forma un complejo con el XPF para catalizar la incisión 5' al sitio del daño), las otras varias subunidades de TFIIH (ver Capítulo 10) y la proteína de unión monocatenaria RPA.

Cuadro 7.2: Genes afectados en pacientes con XP y proteínas codificadas

Gen Humano	Función Proteína	Homóloga a S. cerevisiae	Análogo a E. coli
XPA	Se une al ADN dañado	Rad14	UVRA/UVRB
XPB	Helicasa de 3' a 5', componente de TFIIH	Rad25	UvRD
XPC	Sensor de daños en el ADN (en complejo con HHR23b)	Rad4
XPD	Helicasa 5' a 3', componente de TFIIH	Rad3	UvRD
XPE	Se une al ADN dañado		UVRA/UVRB
XPF	Funciona con ERRC1 para cortar ADN en el lado 5' del daño	Rad1	UVRB/UVRC
XPG	Corta el ADN en el lado 3' del daño	Rad2	UVRB/UVRC

La NER ocurre de dos modos en muchos organismos, incluyendo bacterias, levaduras y mamíferos. Una es la reparación global que actúa a lo largo del genoma, y la segunda es una actividad especializada es que se acopla a la transcripción. La mayoría de los productos génicos XP enumerados en la Tabla 2 funcionan en ambos modos de NER en células de mamífero. Sin embargo, XPC (que actúa en un complejo con otra proteína llamada HHR23b) es un sensor de daño al ADN que es específico para el genoma global NER. En la NER acoplada a transcripción, la ARN polimerasa alargadora se estabiliza en una lesión en la cadena molde; quizás esta es la actividad de reconocimiento de daño para este modo de NER. Uno de los factores de transcripción basales que se asocia con la ARN polimerasa II, TFIIH (ver Capítulo 10), también juega un papel en ambos tipos de NER. Un raro trastorno genético en humanos, el síndrome de Cockayne (CS), se asocia con un defecto específico de la reparación acoplada a la transcripción. Se han identificado dos grupos de complementación, CSA y CSB. La determinación de la naturaleza y actividad de las proteínas codificadas por ellos proporcionará información adicional sobre la reparación eficiente de las cadenas de ADN transcritas. El fenotipo de los pacientes con CS es pleiotrópico, mostrando tanto fotosensibilidad como trastornos neurológicos graves y otros trastornos del desarrollo, incluido el envejecimiento prematuro. Estos síntomas son más graves que los observados en pacientes con XP sin NER detectable, lo que indica que la reparación acoplada a la transcripción o las proteínas CS tienen funciones además de las de NER.

Otras enfermedades genéticas también resultan de una deficiencia en una función reparadora del ADN, como el síndrome de Bloom y la anemia de Fanconi. Se trata de áreas intensivas de investigación actual. Un buen recurso para la información actualizada sobre estas y otras enfermedades hereditarias, así como los genes humanos en general, es la Herencia Mendeliana Online en el Hombre, u OMIM, accesible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

La ataxia telangiectasia, o AT, ilustra el efecto de alteraciones en una proteína que no está directamente involucrada en la reparación, pero quizás la señalización que es necesaria para la correcta reparación del ADN. La AT es una enfermedad genética recesiva, rara, marcada por la marcha desigual (ataxia), dilatación de los vasos sanguíneos (telangiectasia) en los ojos y la cara, degeneración cerebelosa, retraso mental progresivo, deficiencias inmunitarias, envejecimiento prematuro y un aumento de aproximadamente 100 veces en la susceptibilidad a los cánceres. Ese último fenotipo está impulsando gran parte del interés en este locus, ya que los heterocigotos, que comprenden alrededor del 1% de la población, también tienen un mayor riesgo de cáncer, y pueden representar hasta el 9% de los cánceres de mama en Estados Unidos. El gen que está mutado en AT (de ahí llamado “ATM”) se aisló en 1995 y se localizó en el cromosoma 11q22-23.

El gen ATM no parece codificar una proteína que participa directamente en la reparación del ADN (a diferencia de los genes que causan XP tras la mutación). Más bien, la AT es causada por un defecto en una vía de señalización celular. Basado en homologías con otras proteínas, el producto génico ATM puede estar involucrado en la regulación de la longitud de los telómeros y la progresión del ciclo celular. El dominio C-terminal es homólogo a la fosfatidilinositol-3-quinasa (que también es una proteína quinasa Ser/Thr), de ahí la conexión a las vías de señalización. La proteína ATM también tiene regiones de homología con las proteínas quinasas dependientes de ADN, que requieren roturas, mellas o huecos para unirse al ADN (a través de la subunidad Ku); la unión al ADN es necesaria para la actividad de la proteína quinasa. Esto sugiere que la proteína ATM podría estar involucrada en dirigir la maquinaria de reparación a tales daños.

Reparación de Escisión de Base

La reparación por escisión de bases difiere de la reparación por escisión de nucleótidos en los tipos de sustratos reconocidos y en el evento de escisión inicial. A diferencia de la NER, la maquinaria de escisión de bases reconoce bases dañadas que no causan una distorsión significativa a la hélice del ADN, como los productos de los agentes oxidantes. Por ejemplo, la escisión de bases puede eliminar uridinas del ADN, aunque un par de bases G:U no distorsiona el ADN. La reparación por escisión de bases es versátil, y este proceso también puede eliminar algunas bases dañadas que distorsionan el ADN, como las purinas metiladas. En general, el reconocimiento inicial es una base dañada específica, no una distorsión helicoidal en el ADN. Una segunda diferencia importante es que la escisión inicial se dirige al enlace glicosídico que conecta la base purina o pirimidina con una desoxirribosa en el ADN. Esto contrasta con la escisión inicial de un enlace fosfodiéster en la NER.

Las células contienen un gran número de glicosilasas específicas que reconocen bases dañadas o inapropiadas, como el uracilo, del ADN. La glicosilasa elimina la base dañada o inapropiada catalizando la escisión del enlace N-glicosídico que une la base a la cadena principal de azúcar-fosfato. Por ejemplo, la uracil-N-glicosilasa, el producto del gen ung, reconoce uracilo en el ADN y corta el enlace N-glicosídico entre la base y la desoxirribosa (Figura 7.15). Otras glicosilasas reconocen y escinden bases dañadas. Por ejemplo, la metilpurina glicosilasa elimina G y A metilados del ADN. El resultado de la actividad de estas glicosilasas es un sitio apurínico/apirimidínico, o sitio AP (Figura 7.15). En un sitio AP, el ADN sigue siendo un dúplex intacto, es decir, no hay roturas en el esqueleto del fosfodiéster, pero una base ha desaparecido.

A continuación, una endonucleasa AP corta el ADN justo 5' al sitio AP, proporcionando así un cebador para la ADN polimerasa. En E. coli, la función exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa I elimina la región dañada y rellena con el ADN correcto (usando la polimerasa 5' a 3', dirigida por la secuencia de la cadena complementaria no dañada).

Se han desarrollado mecanismos adicionales para mantener las U fuera del ADN. E. coli también tiene una dUTPasa, codificada por el gen dut, que cataliza la hidrólisis de dUTP a dUMP. El producto dUMP es el sustrato para la timidilato sintetasa, que cataliza la conversión de dUMP a dTMP. Esto mantiene baja la concentración de dUTP en la célula, reduciendo la posibilidad de que se utilice en la síntesis de ADN. Así, la acción combinada de los productos de los genes dut + ung ayuda a prevenir la acumulación de U en el ADN.

Ejercicio

En la reparación por escisión de bases, ¿qué enzimas son específicas para un tipo particular de daño y cuáles se utilizan para todas las reparaciones por esta vía?

Figura 7.15. La reparación de la escisión de bases es iniciada por una glicosilasa que reconoce y elimina bases químicamente dañadas o inapropiadas en el ADN. La glicosilasa escinde el enlace glicosídico entre la base y el azúcar, dejando un sitio apurínico/apirimidínico. La endonucleasa AP puede entonces cortar la cadena principal fosfodiéster 5' al sitio AP. Cuando la ADN polimerasa I se une al extremo del cebador libre en la mella, su actividad exonucleasa 5'-3' corta algunos nucleótidos por delante de la base faltante, y su actividad de polimerización llena el hueco completo de varios nucleótidos.

Reparación de desajuste

El tercer tipo de reparación por escisión que consideraremos es la reparación de desajustes, que se utiliza para reparar errores que ocurren durante la síntesis de ADN. La revisión durante la replicación es buena pero no perfecta. Incluso con una subunidad e funcional, la ADN polimerasa III permite incorporar el nucleótido equivocado aproximadamente una vez por cada 108 pb sintetizados en E. coli. Sin embargo, la tasa de mutación medida en bacterias es tan baja como un error por 1010 o 1011 pb. Las enzimas que catalizan la reparación de desapareamientos son responsables de este grado final de precisión. Reconocen los nucleótidos mal incorporados, los extirpan y los reemplazan con los nucleótidos correctos. A diferencia de la reparación por escisión de nucleótidos, la reparación de desapareamientos no opera en aductos voluminosos o distorsiones mayores en la hélice del ADN. La mayoría de los desapareamientos son sustitutos dentro de una clase química, por ejemplo, una C incorporada en lugar de una T. Esto causa solo distorsiones helicoidales sutiles en el ADN, y el nucleótido mal incorporado es un componente normal del ADN. La capacidad de una célula para reconocer un desajuste refleja la exquisita especificidad de los MUT, que pueden distinguir los pares de bases normales de los resultantes de la mala incorporación. Por supuesto, la maquinaria de reparación necesita saber cuál de los nucleótidos en un par de desapareamiento es el correcto y cuál fue mal incorporado. Lo hace determinando qué hebra se sintetizó más recientemente, y reparando el desajuste en la hebra naciente.

En E. coli, la metilación de A en un motivo GATC proporciona un marcador covalente para la cadena parental, por lo que la metilación del ADN se usa para discriminar cadenas parentales de progenie. Recordemos que la metilasa dam cataliza la transferencia de un grupo metilo a la A de la secuencia pseudopalindrómica GATC en ADN dúplex. La metilación se retrasa varios minutos después de la replicación. En este intervalo antes de la metilación de la nueva cadena de ADN, el sistema de reparación de desapareamientos puede encontrar desapareamientos y dirigir su actividad reparadora a nucleótidos en la cadena no metilada recién replicada. Así, los errores de replicación se eliminan preferentemente.

El complejo enzimático Muth-mutl-muts, o MuthLS, cataliza la reparación de desapareamientos en E. coli. Los genes que codifican estas enzimas, mutH, mutL y mutS, fueron descubiertos porque las cepas portadoras de mutaciones en ellas tienen una alta frecuencia de nuevas mutaciones. A esto se le llama fenotipo mutador, y de ahí se le dio el nombre mut a estos genes. No todos los genes mutadores están involucrados en la reparación de desapareamientos; por ejemplo, las mutaciones en el gen que codifica la enzima correctora de la ADN polimerasa III también tienen un fenotipo mutador. Este gen fue descubierto independientemente en pantallas de defectos en la replicación del ADN (ADNQ) y genes mutadores (mutD). Tres grupos de complementación dentro del conjunto de alelos mutadores han sido implicados principalmente en la reparación de desapareamientos; estos son MuTh, MuTl y MuTs.

Los MUT reconocerán siete de los ocho posibles pares de bases desapareados (excepto C:C) y se unirán en ese sitio en el ADN dúplex (Figura 7.16). MuTH y MutL (con ATP unido) luego se unen al complejo, que luego se mueve a lo largo del ADN en cualquier dirección hasta encontrar un motivo GATC hemimetilado, que puede estar a unos pocos miles de pares de bases de distancia. Hasta este punto, la función nucleasa de MuTH ha estado latente, pero se activa en presencia de ATP en un GATC hemimetilado. Escinde la cadena de ADN no metilada, dejando una mella 5' a la G en la hebra que contiene el GATC no metilado (es decir, la nueva cadena de ADN). La misma hebra se mella en el otro lado del desajuste. Las enzimas involucradas en otros procesos de reparación y replicación catalizan los pasos restantes. El segmento de ADN monocatenario que contiene el nucleótido incorrecto debe ser escindido por UvRD, también conocido como helicasa II y MuTu. SSB y exonucleasa I también están involucrados en la escisión. A medida que el proceso de escisión forma la brecha, se rellena con la acción concertada de la ADN polimerasa III (Figura 7.16.).

Figura 7.16 (parte 1). Reparación de desapareamientos por MUTHL: reconocimiento de desapareamientos (mostrado en rojo), identificación de la nueva cadena de ADN (usando el GATC hemimetilado mostrado en azul) y corte para abarcar el GATC no metilado y el nucleótido mal incorporado (G rojo).

Figura 7.16 (parte 2). Reparación de desapareamientos: escisión del ADN con el nucleótido bu Uvr D mal incorporado (ayudado por exonucleasa I y SSB), llenado de huecos por ADN polimerasa III y ligación.

La reparación de desapareamientos está altamente conservada, y la investigación de este proceso en ratones y humanos está proporcionando nuevas pistas sobre mutaciones que causan cáncer.Se han identificado homólogos de los genes de E. coli mutL y muT en muchas otras especies, incluidos los mamíferos. El avance clave vino del análisis de mutaciones que causan uno de los cánceres hereditarios más comunes, el cáncer de colon hereditario no poliposis (HNPCC). Algunos de los genes que, al mutar, provocan esta enfermedad codifican proteínas cuyas secuencias de aminoácidos son significativamente similares a las de dos de las enzimas reparadoras de desapareamientos de E. coli. Los genes humanos se denominan hMLH1 (para el homólogo 1 de mutL humano), hMSH1 y hMSH2 (para los homólogos 1 y 2 de MuTs humanos, respectivamente). Trabajos posteriores han demostrado que estas enzimas en humanos están involucradas en la reparación de desapareamientos. Presumiblemente, el aumento de la frecuencia de mutación en células deficientes en reparación de desapareamientos conduce a la acumulación de mutaciones en protooncogenes, dando como resultado una desregulación del ciclo celular y pérdida del control normal sobre la tasa de división celular.

Ejercicio

Los homólogos humanos de enzimas bacterianas implicadas en la reparación de desapareamientos también están implicados en funciones homólogas. Dados los homólogos humanos discutidos anteriormente, ¿qué funciones enzimáticas encontradas en la reparación de desapareamientos bacterianos también se encuentran en humanos ¿Qué funciones faltan y, por lo tanto, probablemente las lleve a cabo una enzima no homóloga a las utilizadas en la reparación de desapareamientos bacterianos?

Reparación de recombinación (sistema de recuperación)

En los tres tipos de reparación por escisión, los nucleótidos dañados o mal incorporados se cortan del ADN, y la cadena restante de ADN se usa para la síntesis de la secuencia de ADN correcta. Sin embargo, esta cadena complementaria no siempre está disponible. A veces, la ADN polimerasa tiene que sintetizar más allá de una lesión, como un dímero de pirimidina o un sitio AP. Una forma en que puede hacer esto es detenerse en un lado de la lesión y luego reanudar la síntesis unos 1000 nucleótidos más abajo. Esto deja un hueco en la hebra opuesta a la lesión (Figura 7.17).

La información necesaria en el hueco es recuperada de la molécula hija normal mediante la incorporación de una sola cadena de ADN, utilizando recombinación mediada por RecA (ver Capítulo VIII). Esto llena el hueco opuesto al dímero, y el dímero ahora puede ser reemplazado por reparación por escisión (Figura 7.17). El hueco resultante en la hija (anteriormente) normal puede ser rellenado por ADN polimerasa, utilizando el buen molde.

Figura 7.17. Reparación por recombinación, un sistema de recuperación de información

Síntesis de Translesión

Como se acaba de describir, la ADN polimerasa puede saltarse más allá de una lesión en la cadena molde, dejando atrás un hueco. Tiene otra opción cuando se encuentra dicha lesión, que es sintetizar ADN de manera no dirigida a moldes. Esto se llama síntesis translesional, síntesis de bypass o reparación propensa a errores. Este es el último recurso para la reparación del ADN, por ejemplo, cuando la reparación no ha ocurrido antes de la replicación. En la replicación translesional, la ADN polimerasa cambia de la síntesis dirigida por molde a catalizar la incorporación de nucleótidos aleatorios. Estos nucleótidos aleatorios suelen ser mutaciones (es decir, en tres de cuatro veces), por lo que este proceso también se denomina reparación propensa a errores.

La síntesis translesional utiliza los productos de los genes uMuC y uMUD. Estos genes se nombran por el fenotipo de tabla U V non mu de mutantes defectuosos en estos genes

Ejercicio

Pregunta 7.11. ¿Por qué las mutaciones en los genes requeridos para la síntesis translesional (reparación propensa a errores) conducen a un fenotipo no mutable?

UMud forma un homodímero que también se compleja con uMuC. Cuando se incrementa la concentración de ADN monocatenario y RecA (por daño en el ADN, ver siguiente sección), RecA estimula una actividad de autoproteasa en uMUD ₂ para formar _uMUD2. Esta forma escindida ahora está activa en la síntesis translesional. La UMuC en sí es una ADN polimerasa. Un complejo multisubunidad que contiene uMuC, la Umud' ₂ activada y la subunidad a de la ADN polimerasa III catalizan la síntesis translesional. Los homólogos de la polimerasa uMuC se encuentran en levaduras (RAD30) y humanos (XP-V).

El SOSResponse

Una batería coordinada de respuestas al daño del ADN en E. coli se conoce como la respuesta SOS. Este nombre se deriva de la llamada de socorro marítimo, “SOS” para “Save Our Ship”. La acumulación de daño al ADN, por ejemplo, de altas dosis de radiación que rompen la cadena principal del ADN, generará regiones monocatenarias en el ADN. Las cantidades crecientes de ADN monocatenario inducen funciones SOS, que estimulan tanto la reparación de recombinación como la síntesis translesional que se acaba de discutir.

Las proteínas clave en la respuesta SOS son RecA y LexA. RecA se une a regiones monocatenarias en el ADN, lo que activa nuevas funciones en la proteína. Una de ellas es la capacidad de activar aún más una actividad proteolítica latente que se encuentra en varias proteínas, entre ellas el represor LexA, la proteína uMUD y el represor codificado por el bacteriófago lambda (Figura 7.18). RecA activado por la unión al ADN monocatenario no es en sí mismo una proteasa, sino que sirve como coproteasa, activando la función proteolítica latente en LexA, uMUD y algunas otras proteínas.

En ausencia de daños apreciables en el ADN, la proteína lexA reprime muchos operones, incluyendo varios genes necesarios para la reparación del ADN: recA, lexA, uvrA, uvrB y uMuC. Cuando la RecA activada estimula su actividad proteolítica, se escinde a sí misma (y otras proteínas), conduciendo a la inducción coordinada de los operones regulados por SOS (Figura 7.18).

Figura 7.18. ReCa y LexA controlan la respuesta SOS.

Sistemas de restricción/modificación

Los sistemas de reparación de ADN discutidos anteriormente operan mediante la vigilancia del genoma en busca de daños o mala incorporación y luego traen máquinas enzimáticas para reparar los defectos. Otros sistemas de vigilancia en genomas bacterianos son los sistemas de restricción/modificación. Estos buscan ADN extraño que haya invadido la célula, para después destruirla. En efecto, este es otro medio de proteger al genoma del daño que podría resultar de la integración de ADN extraño.

Estos sistemas para salvaguardar la célula bacteriana de la invasión por ADN extraño utilizan una combinación de modificación covalente y restricción por una endonucleasa. Cada especie de bacteria modifica su ADN por metilación en sitios específicos (Figura 7.19). Esto protege al ADN de la escisión por la endonucleasa de restricción correspondiente. Sin embargo, cualquier ADN extraño (por ejemplo, de un bacteriófago infectante o de una especie diferente de bacteria) no será metilado en ese sitio, y la endonucleasa de restricción escindirá allí. El resultado es que el ADN invasor será cortado e inactivado, sin dañar el ADN del huésped.

Figura 7.19. Sistemas de restricción/modificación en bacterias.

Cualquier ADN que escape a la endonucleasa de restricción será un sustrato para la metilasa. Una vez metilada, la bacteria ahora la trata como su propio ADN, es decir, no lo escinde. Este proceso se puede controlar genética y bioquímicamente para ayudar en el trabajo del ADN recombinante. Generalmente, la endonucleasa de restricción se codifica en el locus r y la metiltransferasa se codifica en el locus m. De esta manera, el paso de un ADN plasmídico a través de una cepa r‑m+ (defectuosa en restricción pero competente para la modificación) lo hará resistente a la restricción por cepas con un gen r+ de tipo silvestre. Para algunos sistemas de restricción/modificación, tanto la endonucleasa como la metiltransferasa están disponibles comercialmente. En estos casos, se puede modificar el ADN extraño (por ejemplo, de seres humanos) antes de ligarlo en vectores de clonación para protegerlo de la escisión por las endonucleasas de restricción que pueda encontrar después de la transformación en bacterias.

Para los sistemas de restricción/modificación tipo II, la metilación y restricción ocurre en el mismo sitio pseudopalindrómico. Estos son los sistemas más comunes, con una especificidad de secuencia diferente para cada especie bacteriana. Esto ha proporcionado la gran variedad de endonucleasas de restricción que son tan comúnmente utilizadas en biología molecular.

Colaboradores y Atribuciones

• Template:ContribHardison