8.9: Generación de hebras individuales

Una de las vías principales para generar extremos monocatenarios 3' utiliza la enzima RecBCD, también conocida como exonucleasa V (Figura 8.13). Las tres subunidades de esta enzima están codificadas por los genes recB, recC y recD. Cada modelo de recombinación requiere de una sola hebra con un extremo libre para la invasión de cadena, y esta enzima lo hace, pero con varias características inesperadas.

RecBCD tiene múltiples funciones, y puede cambiar de actividades. Es una helicasa (en presencia de SSB), una ATPasa y una nucleasa. La nucleasa puede ser una exonucleasa 3' a 5', y una endonucleasa o una exonucleasa 5' a 3', en diferentes etapas del proceso.

La actividad helicasa de la enzima recBCD inicia el desenrollado solo en el ADN que contiene un extremo dúplex libre. Se une al extremo dúplex, utilizando la energía de la hidrólisis de ATP para viajar a lo largo del dúplex, desenrollando el ADN. El complejo enzimático rastrea a lo largo de la cadena superior más rápido que en la cadena inferior, por lo que los bucles monocatenarios emergen, cada vez más grandes a medida que se mueve hacia abajo por el dúplex. Estos bucles se pueden visualizar en micrografías electrónicas. RecBCD también es una exonucleasa 3' a 5' durante esta fase, eliminando el extremo de una de las hebras desenrolladas (Figura 8.13).

Figura 8.13. Generación de un extremo 3' monocatenario por la enzima recBCD

Las actividades de la enzima recBCD cambian en secuencias particulares en el ADN llamadas sitios chi (para la letra griega c). La secuencia de un sitio chi es 5' GCTGGTGG; esto ocurre aproximadamente una vez cada 4 kb en el genoma de E. coli. Los experimentos genéticos muestran que RecBCD promueve la recombinación con mayor frecuencia en sitios chi. Estos sitios fueron descubiertos por primera vez como mutaciones en el bacteriófago l que llevaron a una mayor recombinación en esos sitios. Estas mutaciones alteraron la secuencia l en el sitio de la mutación para convertirse en un sitio chi (GCTGGTGG).

Cuando la enzima recBCD encuentra un sitio chi, dejará una hebra simple extruida cerca de este sitio (de 4 a 6 nucleótidos 3' a él). Un sitio chi sirve como señal a RecBCD para cambiar la polaridad de su función exonucleasa. Antes de alcanzar el sitio chi, recBCD actúa principalmente como una exonucleasa 3' a 5', por ejemplo trabajando en la cadena superior en la Figura 8.13. En el sitio chi, se suprime la función exonucleasa 3' a 5', y después del sitio chi, recBCD se convierte en una exonucleasa 5' a 3', trabajando ahora en la otra cadena (por ejemplo, la cadena inferior en la Figura 8.13). Presumiblemente, la cadena que será el sustrato para la exonucleasa 5' a 3' se mella en concierto con esta conversión en polaridad de la exonucleasa. Este proceso deja el sitio chi en el extremo 3' de un ADN monocatenario. Este es el sustrato al que se puede unir RecA para iniciar el intercambio de cadenas (ver más adelante).

Algunas pruebas de los modelos de recombinación han examinado si los sitios chi sirven preferentemente como donantes o receptores del ADN durante la recombinación. Sin embargo, se han obtenido ambos resultados, lo que dificulta vincular esta actividad precisamente en cualquiera de los modelos de recombinación. La evidencia genética es clara, sin embargo, que es necesaria para una vía importante de recombinación.

Ejercicio 8.4

¿Cuáles son las predicciones del modelo Holliday y del modelo de doble hebra para determinar si los sitios chi se usarían como donantes o receptores de información genética durante la recombinación?

Una vía alternativa para generar extremos monocatenarios para recombinación utiliza la enzima RecE, también conocida como exonucleasa VIII. Esta vía se revela en los mutantes recBCD-. RecE es una exonucleasa de 5' a 3' que digiere el ADN lineal bicatenario, generando así colas 3' monocatenarias. RecE está codificado en un plásmido críptico en E. coli. Es similar a la exonucleasa roja codificada por el bacteriófago l.

Una tercera vía utilizó la helicasa RecQ, que también es una ATPasa dependiente de ADN. Esta vía se revela en los mutantes recBCD- RecE-. El resultado de su actividad helicasa, en presencia de SSB, es la formación de una molécula de ADN con colas 3' monocatenarias, que puede ser utilizada para la invasión de cadenas.

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