9.6: Clases de elementos transponibles

Las dos clases principales de elementos transponibles están definidas por los intermedios en el proceso de transposición. Una clase se mueve por intermedios de ADN, usando transposasas y ADN polimerasas para catalizar la transposición. La otra clase se mueve por intermedios de ARN, utilizando ARN polimerasa, endonucleasas y transcriptasa inversa para catalizar el proceso. Ambas clases son abundantes en muchas especies, pero algunos grupos de organismos tienen preponderancia de una u otra. Por ejemplo, las bacterias tienen principalmente la clase intermedia de ADN de elementos transponibles, mientras que los elementos transponibles predominantes en los genomas de mamíferos se mueven por intermedios de ARN.

• Elementos transponibles que se mueven a través de intermedios de ADN
• Elementos transponibles que se mueven a través de intermedios de ARN

Elementos transponibles que se mueven a través de intermedios de ADN

Entre los elementos transponibles más caracterizados se encuentran aquellos que se mueven por intermedios de ADN. En bacterias, estas son secuencias de inserción cortas o transposones más largos.

Una secuencia de inserción, o IS, es una secuencia de ADN corta que se mueve de una ubicación a otra. Primero fueron reconocidos por las mutaciones que provocan al insertarse en genes bacterianos. Diferentes secuencias de inserción varían en tamaño de aproximadamente 800 pb a 2000 pb. La secuencia de ADN de un IS tiene repeticiones invertidas (aproximadamente 10 a 40 pb) en sus extremos (Figura 9.10A.). Tenga en cuenta que esto es diferente de los FDR, que son duplicaciones del sitio objetivo. Las repeticiones invertidas son parte del propio elemento IS. Las secuencias de las repeticiones invertidas en cada extremo del IS son muy similares pero no necesariamente idénticas. Cada familia de secuencia de inserción en una especie se denomina IS seguido de un número, por ejemplo, IS1, IS10, etc.

Una secuencia de inserción codifica una enzima transposasa que cataliza la transposición. La cantidad de transposasa está bien regulada y es el determinante primario de la tasa de transposición. Los transposones son elementos transponibles más grandes, que varían en tamaño de 2500 a 21,000 pb. Generalmente codifican un gen farmacorresistente u otro marcador además de las funciones requeridas para la transposición (Figura 9.10.B.). Un tipo de transposón, llamado transposón compuesto, tiene un elemento IS en cada extremo (Figura 9.10.C.). Uno o ambos elementos IS pueden ser funcionales; estos codifican la función de transposición para esta clase de transposones. Los elementos IS flanquean el gen de resistencia a fármacos (u otro marcador seleccionable). Es probable que el transposón compuesto evolucionara cuando dos elementos IS se insertaron en ambos lados de un gen. Los elementos IS al final podrían moverse por sí mismos o pueden reconocer los extremos de los elementos IS estrechamente espaciados y moverlos junto con el ADN entre ellos. Si el ADN entre los elementos IS confiere una ventaja selectiva cuando se transpone, entonces se fijará en una población.

Ejercicio 9.3

¿Cuáles son las predicciones de este modelo para la formación de un transposón compuesto para la situación en la que un transposón en un pequeño replicón circular, como un plásmido?

Figura 9.10. Estructura general de secuencias de inserción y transposones. Las repeticiones directas flanqueantes (FDR) se muestran como triángulos verdes, las repeticiones invertidas (IR) son triángulos rojos o morados, las secuencias de inserción (ISs) son cajas amarillas con triángulos rojos al final y otros genes son cajas de diferentes colores. Las cajas y triángulos incluyen ambas cadenas de ADN dúplex. El ADN fuera de los FDR se muestra como una línea azul gruesa para cada hebra. Tn5 tiene un elemento IS50 en cada lado, en una orientación invertida. Las transcripciones se muestran como líneas rizadas con una punta de flecha apuntando en la dirección de la transcripción. El gen neo ^R para Tn5 está compuesto en parte por el IS hacia la izquierda (ISL) y en parte por otras secuencias (incluidas en la caja azul). La transposasa para Tn5 está codificada en el IS hacia la derecha (ISR).

La familia TnA de transposones ha sido estudiada intensamente para determinar el mecanismo de transposición. Los miembros de la familia TnA tienen repeticiones invertidas terminales, pero carecen de elementos IS terminales (Figura 9.10). El gen tnpA del transposón tNA codifica una transposasa y el gen TnPr codifica una resolvasa. TnA también tiene un marcador seleccionable, Ap R, que codifica una beta-lactamasa y hace que la bacteria sea resistente a la ampicilina.

Los elementos transponibles que se mueven a través de intermedios de ADN no se limitan a las bacterias, sino que se encuentran en muchas especies. Los elementos P y la familia copia de repeticiones son ejemplos de tales elementos transponibles en Drosophila, así como los elementos marineros en mamíferos y los elementos controladores en las plantas. De hecho, la estructura general de los elementos controladores en el maíz es similar a la de los transposones bacterianos. En particular, terminan en repeticiones invertidas y codifican una transposasa. Como se ilustra en la Figura 9.11, las secuencias de ADN en los extremos de un elemento Ac son muy similares a las de un elemento Ds. Sin embargo, las regiones internas, que normalmente codifican la transposasa, han sido eliminadas. Es por ello que los elementos Ds no pueden transponerse por sí mismos, sino que requieren la presencia del transposón intacto, Ac, en la célula para proporcionar la transposasa. Dado que la transposasa funciona en trans, el elemento Ac puede estar en cualquier parte del genoma, pero puede actuar sobre elementos Ds en una variedad de sitios. Tenga en cuenta que Ac es un transposón autónomo porque proporciona su propia transposasa y tiene las repeticiones invertidas necesarias para actuar como sustrato para la transposasa.

Figura 9.11. La estructura de los elementos controladores Ac y Ds en maíz es similar a la de un transposón intacto (Ac) o defectuoso (Ds).

Mecanismo de transposición mediada por ADN

Algunas familias de elementos transponibles que se mueven a través de un intermedio de ADN lo hacen de manera replicativa. En este caso, la transposición genera una nueva copia del elemento transponible en el sitio objetivo, al tiempo que deja una copia atrás en el sitio original. Una estructura de cointegración se forma mediante la fusión de los replicones donante y receptor, que luego se resuelve (Figura 9.12). Otras familias utilizan un mecanismo no replicativo. En este caso, la copia original extrae del sitio original y se traslada a un nuevo sitio objetivo, dejando vacante el sitio original.

Figura 9.12: Contrastes entre transposición replicativa y no replicativa. El elemento transponible (TE) se muestra como una flecha abierta. La línea gruesa para cada replicón representa ADN bicatenario; los diferentes sombreados representan diferentes secuencias.

Estudios de transposones bacterianos han demostrado que la transposición replicativa y algunos tipos de transposición no replicativa proceden a través de un intermedio de transferencia de cadena (también conocido como estructura cruzada), en el que tanto los replicones donantes como los receptores se unen al elemento transponible (Figura 9.13). Para la transposición replicativa, la síntesis de ADN a través del intermedio de transferencia de cadena produce un elemento transponible tanto en el sitio donante como en el objetivo, formando el intermedio cointegrado. Esto se resuelve posteriormente para separar los replicones. La síntesis de ADN no ocurre en la estructura cruzada en transposición no replicativa, dejando así una copia solo en el nuevo sitio diana. En una vía alternativa para la transposición no replicativa, el transposón se escinde mediante dos roturas de doble cadena, y se une al receptor en una ruptura escalonada (ilustrada en la parte inferior de la Figura 9.12).

Con más detalle, hay dos pasos en común para la transposición replicativa y no replicativa, generando el intermedio de transferencia de cadena (Figura 9.13).

1. La transposasa codificada por un elemento transponible hace cuatro mellas inicialmente. Se realizan dos mellas en el sitio diana, una en cada hebra, para generar una ruptura escalonada con extensiones 5' (3' rebajadas). Las otras dos mellas flanquean el transposón; una mella se hace en una hebra de ADN en un extremo del transposón, y la otra mella se realiza en la otra hebra de ADN en el otro extremo. Dado que el transposón tiene repeticiones invertidas en cada extremo, estas dos mellas que flanquean el transposón son escisiones en la misma secuencia. Así, la transposasa tiene una actividad de mellado específica de secuencia. Por ejemplo, la transposasa de tNA se une a una secuencia de aproximadamente 25 pb localizada dentro de los 38 pb de repetición terminal invertida (Figura 9.10). Se mella una sola hebra en cada extremo del transposón, así como el sitio diana (Figura 9.13). Obsérvese que aunque la diana y el transposón se muestran separados en el dibujo bidimensional de la Figura 9.13, se yuxtaponen durante la transposición.
2. En cada extremo del transposón, el extremo 3' de una cadena del transposón se une a la extensión 5' de una cadena en el sitio diana. Esta ligación también es catalizada por la transposasa. El ATP estimula la reacción pero puede ocurrir en ausencia de ATP si el sustrato está superenrollado. La ligación de los extremos del transposón al sitio diana genera un intermedio de transferencia de cadena, en el que los replicones donante y receptor están ahora unidos por el transposón.

Después de la formación del intermedio de transferencia de hilo, se pueden seguir dos vías diferentes. Para la transposición replicativa, los extremos 3' de cada cadena de la ruptura escalonada (originalmente en el sitio diana) sirven como cebadores para la síntesis de reparación (Figura 9.13). La replicación seguida de ligación conduce a la formación de la estructura cointegrada, que luego se puede resolver en los replicones separados, cada uno con una copia del transposón. La resolvasa codificada por TnA del transposón cataliza la resolución de la estructura cointegrada. El sitio de resolución (res) se localiza entre los genes transcritos divergentemente para TnpA y TnPr (Figura 9.10). La resolvasa de tNA también regula negativamente la expresión de TnPA y TnPr (en sí mismo).

Para la transposición no replicativa, el intermedio de transferencia de cadena se libera mediante mellado en los extremos del transposón no inicialmente mellado. La síntesis de reparación se limita a la brecha en las repeticiones directas flanqueantes, y por lo tanto solo queda una copia del transposón. Esta copia se liga al nuevo sitio diana, dejando un sitio vacante en la molécula donante.

Figura 9.13. Mecanismo de transposición a través de un intermedio de transferencia de hilo.

La enzima transposasa puede reconocer secuencias de ADN específicas, escindir dos moléculas de ADN dúplex en cuatro lugares y ligar cadenas del donante al receptor. Esta enzima tiene una notable capacidad para generar y manipular los extremos del ADN. Rayment y colegas han resuelto una estructura tridimensional para la transposasa Tn5 en complejo con los extremos del ADN de Tn5. Una vista estática de este complejo proteico ADN se encuentra en la Figura 9.14.A. La transposasa es un dímero, y cada molécula de ADN bicatenario (donante y diana) está unida por ambas subunidades proteicas. Esto orienta los extremos del transposón hacia los sitios activos, como se muestra en la figura. Además, una imagen con solo el ADN (Figura 9.14.B.) muestra una considerable distorsión de la hélice del ADN en los extremos. Esta estructura recientemente determinada es un buen punto de partida para comprender mejor el mecanismo de escisión y transferencia de cadenas.

Figura 9.14. Estructura tridimensional de la transposasa Tn5 en complejo con ADN del transposón Tn5. A. El dímero de la transposasa Tn5 se muestra unido a un fragmento de ADN dúplex desde el extremo del transposón. Las hélices alfa son cilindros verdes, las láminas beta son de color amarillo-marrón, las flechas planas y los bucles de proteína son alambres azules. El ADN es un dúplex de dos hilos rojos, uno por cada hebra. B. El ADN se muestra sin la proteína y con los nucleótidos marcados. El extremo del ADN en la parte superior de este panel se orienta hacia el sitio activo en el centro de la proteína en el panel A. La estructura fue determinada por Davies DR, Goryshin IY, Reznikoff WS, Rayment I. (2000) “Estructura tridimensional del intermedio de transposición complejo sináptico Tn5”. Ciencia 289:77-85. Estas imágenes se obtuvieron descargando las coordenadas atómicas de la Base de Datos de Modelado Molecular en NCBI, visualizándolas con CN3D 3.0 y guardando vistas estáticas como capturas de pantalla. El archivo para observar una imagen tridimensional virtual está disponible en la página web del curso.

Elementos transponibles que se mueven a través de intermedios de ARN

Las secuencias de ADN transponibles que se mueven por un intermedio de ARN se denominan retrotransposones. Son muy comunes en organismos eucariotas, pero también se han encontrado algunos ejemplos en bacterias. Algunos retrotransposones tienen repeticiones terminales largas (LTR) que regulan la expresión (Figura 9.15). Las LTR fueron descubiertas inicialmente en retrovirus. Ahora se han visto en algunos pero no en todos los retrotransposones. Tienen un fuerte promotor y potenciador, así como señales para formar el extremo 3' de los ARNm después de la transcripción. La presencia de la LTR es distintiva para esta familia, y los miembros son referidos como retrotransposones que contienen LTR. Los ejemplos incluyen la familia de levaduras Ty-1 y proviros retrovirales en vertebrados. Los proviros retrovirales codifican una transcriptasa inversa y una endonucleasa, así como otras proteínas, algunas de las cuales son necesarias para el ensamblaje y la estructura viral.

Otros retrotransposones se encuentran en la clase grande y diversa de retrotransposones no LTR (Figura 9.15). Uno de los ejemplos más prevalentes es la familia de l ong en lements repetitivos terspersed, o LINES. Inicialmente se encontró en mamíferos pero ahora se ha encontrado en una amplia gama de filos, incluyendo hongos. La primera y más común familia LINE en mamíferos es la familia LINE1, también llamada L1. Una familia mayor, pero descubierta más tarde, se llama LINE2. Las líneas de longitud completa tienen aproximadamente 7000 pb de largo, y hay alrededor de 10,000 copias en humanos. Muchas otras copias están truncadas desde los extremos 5'. Al igual que los proviros retrovirales, la L1 de longitud completa codifica una transcriptasa inversa y una endonucleasa, así como otras proteínas. Sin embargo, el promotor no es una LTR. Otros retrotransposones abundantes no LTR, descubiertos inicialmente en mamíferos, son s hort en lements repetitivos terspersed, o SINE. Estas son de alrededor de 300 pb de largo. Las repeticiones de Alu, con más de un millón de copias, comprenden la clase predominante de SINE en humanos. Los retrotransposones no LTR además de las líneas se encuentran en muchas otras especies, como las repeticiones jockey en Drosophila.

Figura 9.15. Cuatro clases de elementos transponibles constituyen la gran mayoría del ADN repetitivo humano. Del trabajo de Nature “Secuenciación inicial y análisis del genoma humano”, del Consorcio Internacional del Genoma Humano.

Estudios extensos en secuencias de ADN genómico han permitido la reconstrucción de la historia de los elementos transponibles en humanos y otros mamíferos. El enfoque principal ha sido clasificar los diversos tipos de repeticiones (ellos mismos elementos transponibles), alinear las secuencias y determinar qué tan diferentes son los miembros de una familia entre sí. Dado que la gran mayoría de las repeticiones ya no están activas en la transposición, y no tienen otra función obvia, acumularán mutaciones rápidamente, a la velocidad neutra. Por lo tanto, la secuencia de miembros transpuestos más recientemente es más similar a la secuencia fuente que los miembros que se transpusieron anteriormente. Los resultados de este análisis muestran que las diferentes familias de repeticiones se han propagado en distintas ondas a través de la evolución (Figura 9.16). Los elementos LINE2 fueron abundantes antes de la divergencia de los mamíferos, hace aproximadamente 100 millones de años. Tanto las repeticiones LINE1 como Alu se han propagado más recientemente en humanos. Es probable que los elementos LINE1, que codifican una nucleasa y una transcriptasa inversa, proporcionen funciones necesarias para la transposición y expansión de repeticiones de Alu. Los elementos LINE1 se han expandido en todos los órdenes de mamíferos, pero cada orden tiene un SINE distintivo, todos los cuales se derivan de un gen transcrito por la ARN polimerasa III. Esto ha llevado a la idea de que los elementos LINE1 proporcionan funciones que otras unidades de transcripción diferentes utilizan para la transposición.

Figura 9.16. Distribución por edad de repeticiones en humanos y ratones. Las repeticiones LINE2 y MIR se propagaron antes de la radiación de los mamíferos, hace unos 100 millones de años, pero las repeticiones de Alu están formadas por transposiciones recientes en primates (porción azul claro de los gráficos de barras en a y b). Las repeticiones LINE1 y LTR se transponen con aproximadamente la misma frecuencia que han tenido históricamente en el linaje del ratón (paneles c y d), pero pocas repeticiones aún se transponen en humanos (paneles a y b). Del trabajo de Nature “Secuenciación inicial y análisis del genoma humano”, del Consorcio Internacional del Genoma Humano.

Mecanismo de retrotransposición

Aunque el mecanismo de retrotransposición no se entiende completamente, es evidente que se utilizan al menos dos actividades enzimáticas. Una es una integrasa, que es una endonucleasa que escinde en el sitio de integración para generar una ruptura escalonada (Figura 9.17). La otra es la ADN polimerasa dependiente de ARN, también llamada transcriptasa inversa. Estas actividades están codificadas en algunos retrotransposones autónomos, incluyendo tanto los retrotransposones LTR como los provirusos retrovirales y los retrotransposones no LTR como los elementos LINE1.

El transcrito de ARN del elemento transponible interactúa con el sitio de escisión en el sitio diana de ADN. Una cadena de ADN en el sitio de integración escindido sirve como cebador para la transcriptasa inversa. Esta ADN polimerasa luego copia el ARN en ADN. Esa copia de ADNc del retrotransposón debe convertirse en un producto bicatenario e insertarse en una ruptura escalonada en el sitio diana. Aún no se han establecido las enzimas necesarias para unir el transcrito inverso (primera cadena de la nueva copia) al otro extremo de la ruptura escalonada y para la síntesis de la segunda cadena. Quizás se utilicen algunas funciones de reparación del ADN celular.

Figura 9.17. Transposición a través de un intermedio de ARN en retrotransposones. Las repeticiones LINE1 o L1 se muestran como ejemplo.

El modelo mostrado en la Figura 9.17 es consistente con cualquier ARN que sirva como molde para la síntesis del ADNc a partir de la ruptura escalonada. Sin embargo, el ARNm de LINE1 se usa claramente con mucha más frecuencia que otros ARN. Todavía se está estudiando la base de la preferencia de la maquinaria de retrotransposición para el ARNm de LINE1. Quizás la endonucleasa y la transcriptasa inversa permanecen asociadas con el ARNm que las codifica una vez completada la traducción, de manera que actúan en cis con respecto al ARNm de LINE1. Otras repeticiones que se han expandido recientemente, como las repeticiones de Alu en humanos, pueden compartir determinantes de secuencia con ARNm de LINE1 para esta preferencia cis.

La evidencia clara de que los retrotransposones pueden moverse a través de un ARN intermedio provino de estudios de los elementos Ty-1 de la levadura por Gerald Fink y sus colegas. Colocaron un elemento Ty-1 particular, llamado TyH3 bajo el control de un promotor GAL, de manera que su transcripción (y transposición) pudiera inducirse añadiendo galactosa al medio. También marcaron TyH3 con un intrón. Después de inducir la transcripción de TyH3, se encontraron copias adicionales en nuevas ubicaciones en la cepa de levadura. Cuando estos fueron examinados estructuralmente, se descubrió que el intrón había sido removido. Si el transcrito de ARN es el intermedio en el movimiento del elemento Ty-1, se somete a corte y empalme y se puede eliminar el intrón. De ahí que estos resultados se ajusten a la predicción de una transposición mediada por ARN. Demuestran que durante la transposición, el flujo de información de la secuencia Ty-1 es de ADN a ARN a ADN.

Ejercicio 9.4

Si la levadura Ty-1 se moviera por el mecanismo ilustrado para la transposición replicativa mediada por ADN en la Figura 9.13, ¿qué se predeciría en el experimento que acabamos de esbozar? Además, ¿esperarías un incremento en la transposición cuando se induce la transcripción?

Consecuencias adicionales de la transposición

Los elementos transponibles no sólo pueden interrumpir los genes o alterar su regulación, sino que pueden provocar reordenamientos adicionales en el genoma. La recombinación homóloga puede ocurrir entre dos secuencias casi idénticas cualesquiera. Así, cuando la transposición hace una nueva copia de un elemento transponible, las dos copias son ahora sustratos potenciales para la recombinación. El resultado de la recombinación depende de la orientación de los dos elementos transponibles entre sí. La recombinación entre dos elementos transponibles en una misma orientación sobre un mismo cromosoma conduce a una deleción, mientras que da como resultado una inversión si están en orientaciones opuestas (Figura 9.18).

Figura 9.18. Posibles resultados de recombinación entre dos elementos transponibles.

La preferencia de la maquinaria de retrotransposición para el ARNm de LINE1 no parece ser absoluta. Muchos genes procesados se han encontrado en genomas eucariotas; estos son genes que no tienen intrones. En muchos casos, se observa en el genoma un gen homólogo con intrones, por lo que parece que estos genes procesados han perdido sus intrones. Es probable que estos se formaron cuando el ARNm procesado derivado del gen homólogo con intrones se copió en ADNc y se reinsertó en el genoma. Muchos, pero no todos, de estos genes procesados son pseudogenes, es decir, han sido mutados de tal manera que ya no codifican proteínas. Otros ejemplos de genes procesados activos se han insertado junto a promotores y codifican proteínas funcionales.

Colaboradores y Atribuciones

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