5.5: Laboratorio 4. Métodos de recuento de poblaciones microbianas

Objetivos

• Conocer diferentes métodos para estimar el crecimiento microbiano
• Analizar los efectos del medio ambiente sobre el desarrollo de los microorganismos
• Aplicación práctica de las técnicas de medición del crecimiento microbiano

Desarrollo práctico

Primer día:

Determinar la curva de crecimiento de una cepa de Staphylococcus sp. midiendo el incremento de la masa celular (Densidad óptica) en el tiempo

Preparación del inoculo: Sembrar 1 ml del cultivo de Staphylococcus sp. en un frasco Erlenmeyer que contiene 100 ml de caldo nutritivo, incubar a 150 rpm en un baño a 37º C durante 12 h. Luego del período de incubación, tomar una alícuota de dicho cultivo y medir su absorbancia (DO) a 640 nm.

Comparar el crecimiento de la cepa en diferentes tipos de medios de cultivo

Crecimiento control: inocular 1 ml del cultivo del microorganismo de 12 h a un frasco Erlenmeyer con 100 ml de caldo de cultivo fresco, incubar a 150 rpm en un baño a 37º C. Medir la DO cada 30 min a 1 h aproximadamente, hasta T10. Tabular las lecturas de DO.

Influencia del antibiótico sobre el crecimiento microbiano: inocular 1 ml del cultivo del microorganismo de 12 h a un frasco Erlenmeyer con 100 ml caldo de cultivo fresco, incubar a 150 rpm en un baño a 37ºC. Medir la DO cada 30 min a 1 h y al tiempo 6 (T6) aproximadamente, adicionar el antibiótico a la concentración adecuada. Tabular las lecturas de DO.

Recuento de células viables por el método de dilución a partir del cultivo control y cultivo con antibiótico

A partir del cultivo control y del cultivo con antibiótico a tiempo 6, extraer 2 ml del mismo y realizar el recuento de células viables. A partir de cada cultivo realizar diluciones seriadas factor 10 en solución fisiológica y sembrar 0,1 ml de cada dilución sobre placas de agar nutritivo por duplicado. Incubar a 37ºC durante 24 - 48 h. Realizar el recuento y expresar los resultados como UFC/ml.

Recuento directo al microscopio

Cargar la cámara de recuento a partir de un cultivo de levaduras que posea una suspensión aproximada de 106 cél/ml, utilizando una pipeta Pasteur. Contar al microscopio y estimar el recuento de células teniendo en cuenta las características de la cámara y las diluciones practicadas. Expresar los resultados en cél/ml.

Determinación del número de bacterias por la técnica del NMP

Se practicará el recuento de bacterias coliformes totales en una muestra de agua de río o de pozo u otra, procediendo de la siguiente manera:

• Sembrar las siguientes series de tres tubos con el medio Mac Conkey:
  • 10 ml de agua en 3 tubos con 10 ml de medio de doble concentración
  • 1 ml de agua en 3 tubos con 10 ml de medio de simple concentración.
  • 0,1 ml de agua en 3 tubos con 10 ml de medio de simple concentración.
• Incubar los tubos a 37°C por 24 - 48 h.

Caldo Mac Conkey: Peptona de caseína 20 g, lactosa 10 g, bilis de buey desecada 5 g, púrpura de bromocresol 0,01 g, agua destilada 1000 ml, pH=7

Segundo día

• Confeccionar las curvas de crecimiento a partir de los resultados obtenidos de DO a partir del cultivo de crecimiento control y del cultivo de crecimiento con antibiótico. Calcular los parámetros de crecimiento en cada curva y comparar.
• Realizar los recuentos de células viables en las placas. Calcular y tabular los recuentos de viables en cada curva.
• Observar los tubos de NMP con reacción positiva (producción de gas y viraje ácido del medio), armar el número de serie, obtener el número de tabla y calcular el NMP.

Responda las siguientes preguntas

¿Qué efecto tendría sobre la curva de crecimiento bacteriano (crecimiento control) cada una de las siguientes condiciones?

a) Incubar en un baño con agitación a 25°C

b) Incubar en un baño con agitación a 30°C

c) Incubar en un baño con agitación a 37°C

d) Utilizar como inóculo un cultivo de 48 hs de crecimiento en vez de las 12 hs recomendadas.

Tratamiento de los materiales usados:

• Una vez finalizado el trabajo de laboratorio, limpie adecuadamente las mesadas de trabajo con alcohol al 70% o hipoclorito de sodio al 1%.
• Descarte todo material contaminado en las bolsas para residuos patógenos.
• Lávese las manos con jabón.