3.9: Laboratorio 2. Esterilización y preparación de medios de cultivo
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- Preparar y esterilizar material de uso común en el laboratorio microbiológico.
- Aprender el manejo de aparatos más comúnmente utilizados en el laboratorio de microbiología.
- Diseñar, elaborar y esterilizar medios de cultivo.
Desarrollo práctico
Primer día:
a) Preparación de material para esterilizar y elección del método de esterilización adecuado.
Complete la siguiente tabla:
|
MATERIAL |
METODO |
CONDICIONES |
|---|---|---|
|
Antibióticos (en solución y sólido) |
||
|
Caja de cirugía |
||
|
Equipo de filtración (presión positiva y negativa) |
||
|
Filtros esterilizantes |
||
|
Glicerol al 15% |
||
|
Granos de cereales |
||
|
Guantes de goma |
||
|
Jeringas de plástico |
||
|
Jeringas de vidrio |
||
|
Microtubos (tipo tubos Eppendorff) |
||
|
Pipetas en pipeteros |
||
|
Pipetas envueltas en papel |
||
|
Placas de Petri (de vidrio y plásticas) |
||
|
Puntas para micropipetas |
||
|
Solución de azúcar al 40% |
||
|
Tapones de goma |
||
|
Tierra |
||
|
Vaselina |
||
|
Vitaminas (en solución y sólida) |
b) Aprendizaje del manejo y cuidado de aparatos más comúnmente utilizados en un laboratorio microbiológico.
- Heladeras (2 a 4°C y congeladores hasta –80°C).
- Cabina de flujo laminar y cabina de seguridad biológica.
- Autoclave.
- Estufas de incubación (28 – 37° C) y estufas de esterilización.
- Homogeneizador de muestras.
- Centrífugas y ultracentrífugas.
- Balanzas de diferente precisión (0,1 g, 0,001g), analíticas y digitales.
- pH-metros.
- Microscopios de campo brillante.
- Liofilizador.
c) Preparación de medios de cultivo:
Cada subgrupo preparará diferentes medios de cultivos: agar nutritivo, agar manitol salado, agar cetrimide, Agar eosina-azul de metileno (EMB).
Consideraciones generales:
- Leer atentamente la fórmula de los medios y calcular la cantidad de cada uno de los componentes químicos.
- Pesar en balanza digital sobre papel aluminio.
- Colocar los componentes en un frasco Erlenmeyer de volumen adecuado y agregar el agua destilada.
- Medir el pH.
- Agregar agar en caso de los medios sólidos.
- Acondicionar para su esterilización en el autoclave.
- Conservar en heladera a 4º C hasta su fraccionamiento.
Agar nutritivo
|
Extracto de carne |
3 g |
|---|---|
|
Peptona |
5 g |
|
NaCl |
8 g |
|
Agar |
15 g |
|
Agua destilada |
1000 ml |
|
pH 7.3 |
Parte del medio de cultivo se esterilizará por autoclave para luego ser fraccionado en placas de Petri estériles y parte, se disolverá por calentamiento a baño de María, se distribuirá en tubos y se esterilizarán por autoclave. Luego del proceso de esterilización, los tubos se inclinarán a fin de obtener tubos en “agar pico de flauta” y tubos con “agar inclinado”.
Medio de manitol saladO (medio de Chapman)
|
Extracto de carne |
1 g |
|---|---|
|
Polipeptona |
10 g |
|
ClNa |
75 g |
|
Manitol |
10 g |
|
Rojo fenol |
0,025 g |
|
Agar |
15 g |
|
Agua destilada |
1000 ml |
Este medio es altamente selectivo para el aislamiento y diferenciación de especies del género Staphylococcus que son patógenas y pone de manifiesto la habilidad de S. aureus de fermentar el manitol. Es selectivo debido a la concentración de ClNa (7,5%, aproximadamente 10 veces más que un medio común), esta concentración elevada de sal inhibe la mayoría de los microorganismos que no pertenecen al género Staphylococcus. El agregado de manitol lo hace al medio diferencial, la utilización de éste azúcar determina la producción de ácido dando como resultado colonias opacas rodeadas de una zona amarilla como consecuencia del viraje del indicador (rojo fenol) de rosa al color amarillo. Esta característica se manifiesta cuando en el medio se desarrolla la especie patógena S. aureus. Cuando no se produce la utilización de éste azúcar se produce la alcalinización del medio, con viraje del indicador de rosa a fucsia. Esta reacción es característica de la especie no patógena S. epidermidis
Medio emb (medio de Levine)
|
Peptona |
10 g |
|---|---|
|
Lactosa |
10 g |
|
Fosfato dipotásico |
2 g |
|
Eosina |
0,4 g |
|
Azul de Metileno |
0,065 g |
|
Agar |
15 g |
|
Agua destilada |
1000 ml |
|
pH 7.3 |
Es un medio selectivo y diferencial recomendado para el aislamiento de bacilos Gram (-) entéricos. El azul de metileno y la eosina inhiben a las bacterias Gram (+) y Gram (-) exigentes, esta característica lo hace selectivo. El agregado de lactosa lo hace diferencial, las bacterias entéricas producen un descenso de pH que da como resultado colonias rojas (lac+). El descenso de pH producido por E. coli hace que se forme una unión amida entre la eosina y el azul de metileno dando como resultado colonias con brillo metálico (lac +).
Agar cetrimide
|
Peptona de gelatina |
20 g |
|---|---|
|
SO4K2 |
10 g |
|
Cl2Mg |
1,4 g |
|
Cetrimide |
0,3 g |
|
Agar |
13,6 g |
|
Agua destilada |
1000 ml |
|
Aditivo: glicerina |
10 ml |
Es un medio selectivo para aislamiento de especies de Pseudomonas a partir de diversos materiales. Posee en su composición Cetrimide (Bromuro de cetiltrimetil amonio) un detergente que provoca una notable inhibición de toda biota acompañante. En este medio también se pone de manifiesto la producción de pigmentos por algunas especies, tales como, Pseudomonas aeruginosa.
Segundo día
a) Fraccionamiento de los medios de cultivos en placa
Una vez esterilizados los diferentes medios de cultivos y antes que solidifiquen se vierten en placas estériles (10 – 20 ml) en cabina de seguridad biológica. Una vez solidificado, se llevan las placas a la estufa de 37º C unos minutos, colocándolas invertidas y destapadas para que se evapore el agua de condensación. Luego se tapan y están listas para ser usadas. Si no se usan en el momento deben ser conservadas a 4º C.
b) Fraccionamiento del agar nutritivo en tubos
Se coloca el agar nutritivo fundido en tubos (1/3 del volumen), se esterilizan y luego se dejan solidificar: a) en forma vertical para obtener agar en columna; b) con una mayor inclinación para agar inclinado; c) y con una menor inclinación para obtener el agar pico de flauta.
c) Discusión teórica de los criterios a tener en cuenta para la selección de un método de esterilización adecuado.
Tratamiento de los materiales usados
- Una vez finalizado el trabajo de laboratorio, limpie adecuadamente las mesadas de trabajo con alcohol al 70% o hipoclorito de sodio al 1%.
- Descarte todo material contaminado en las bolsas para residuos patógenos.
- Lávese las manos con jabón.