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7.25J: Análisis de dos híbridos

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    Objetivos de aprendizaje

    • Diseñar un experimento de dos híbridos

    Comprender cómo las proteínas están físicamente conectadas revela pistas sobre su estructura, función y las convierte en un objetivo ideal para la terapia con medicamentos. Existen varias metodologías para estudiar la interacción de proteínas in vivo. Las herramientas más empleadas son el sistema de dos híbridos de levadura. El sistema de cribado de dos híbridos de levadura es una herramienta eficaz y rápida para el estudio in vivo de la interacción proteína-proteína tanto en procariotas como eucariotas. El método consiste en dividir un factor de transcripción de levadura en su dominio de unión y dominio de activación, fusionar el dominio de unión a una proteína de interés (el cebo) y el dominio de activación a otra proteína de interés (la presa), y reconstituir la actividad del factor de transcripción trayendo los dos dominios vuelven a la proximidad física. En ausencia de una interacción los dominios permanecen distantes, impidiendo una salida detectable. Si las dos proteínas interactúan, el cebo recluta a la presa a una ubicación celular específica donde puede estimular una salida detectable (por ejemplo, activación génica). Este enfoque experimental mide la interacción física directa entre proteínas y se denomina método binario. Los conjuntos de datos obtenidos de tales herramientas se analizan mediante métodos computacionales para dibujar un mapa de conectividad proteica y lograr la comprensión a nivel de sistema de un microorganismo.

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    Figura: Técnica de dos híbridos: Visión general del ensayo de dos híbridos, comprobando las interacciones entre dos proteínas, llamadas aquí Bait y Prey.

    Una limitación de los cribamientos clásicos de dos híbridos de levadura es que están limitados a proteínas solubles. Por lo tanto, es imposible utilizarlos para estudiar las interacciones proteína-proteína entre proteínas de membrana integrales insolubles. El sistema split- ubiquitina proporciona un método para superar esta limitación. En el sistema de ubiquitina dividida, dos proteínas integrales de membrana a estudiar se fusionan a dos restos de ubiquitina diferentes: un resto de ubiquitina C-terminal (“Cub”, residuos 35—76) y un resto de ubiquitina N-terminal (“Nub”, residuos 1—34). Estas proteínas fusionadas se llaman cebo y presa, respectivamente. Además de estar fusionado a una proteína de membrana integral, el resto Cub también se fusiona a un factor de transcripción (TF) que puede ser escindido por proteasas específicas de ubiquitina. Tras la interacción cebo-presa, los grupos Nub y Cub se ensamblan, reconstituyendo la ubiquitina dividida. La molécula de ubiquitina dividida reconstituida es reconocida por proteasas específicas de ubiquitina, que escinden la proteína indicadora, lo que le permite inducir la transcripción de genes informadores.

    Resumen

    Una parte clave del análisis funcional de genes y el descubrimiento potencial de diana farmacológica es la comprensión de cómo interactúan las proteínas dentro de la célula. Los productos disponibles en el mercado facilitan la caracterización de estas interacciones en sistemas de levaduras. El formato básico implica la creación de dos moléculas híbridas, una en la que se fusiona una proteína “cebo” con un factor de transcripción, y otra en la que se fusiona una proteína “presa” con un factor de transcripción relacionado. Si las proteínas cebo y presa efectivamente interactúan, entonces los dos factores fusionados a estas dos proteínas también se acercan entre sí.

    Términos Clave

    • computacional: De o relativo a cómputos.
    • ubiquitina: Una pequeña secuencia proteica reguladora que dirige las proteínas a compartimentos específicos dentro de la célula. Específicamente, una etiqueta de ubiquitina dirige la proteína a un proteasoma, que destruye y recicla los componentes.
    CC CONTENIDO LICENCIADO, ATRIBUCIÓN ESPECÍFICA

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