7.26A: Mapeo de interacciones proteína-proteína

Objetivos de aprendizaje

• Comparar las técnicas utilizadas para mapear las interacciones proteína-proteína

En los organismos vivos, la mayoría de las funciones biológicas están mediadas por complejas maquinarias de proteínas multicomponentes y actividades de red. Los complejos proteicos formados podrían ser estables (las proteínas interactúan durante un periodo prolongado de tiempo) o transitorios (las proteínas interactúan por un breve periodo de tiempo). Los estudios moleculares son necesarios para diseccionar los constituyentes de estos complejos proteicos e identificar los dominios a través de los cuales una proteína interactúa con otra. Comprender cómo las proteínas están físicamente conectadas revela pistas sobre su estructura y función y las convierte en un objetivo ideal para la terapia con medicamentos. Existen varias metodologías para estudiar la interacción de proteínas in vivo. Las herramientas más empleadas son el sistema de dos híbridos de levadura y la purificación por afinidad acoplada a la espectrometría de masas. Los conjuntos de datos obtenidos de tales herramientas se analizan mediante métodos computacionales para dibujar un mapa de conectividad proteica y lograr la comprensión a nivel de sistema de un microorganismo. El mapa completo de interacciones proteicas que pueden ocurrir en un organismo vivo se llama interactoma.

El sistema de dos híbridos de levadura

El sistema de cribado de dos híbridos de levadura es una herramienta eficaz y rápida para el estudio in vivo de la interacción proteína-proteína tanto en procariotas como eucariotas. El método consiste en dividir un factor de transcripción de levadura en su dominio de unión y dominio de activación, fusionar el dominio de unión a una proteína de interés (el cebo) y el dominio de activación a otra proteína de interés (la presa), y reconstituir la actividad del factor de transcripción trayendo los dos dominios vuelven a la proximidad física. En ausencia de una interacción los dominios permanecen distantes, impidiendo una salida detectable. Si las dos proteínas interactúan, el cebo recluta a la presa a una ubicación celular específica donde puede estimular una salida detectable (por ejemplo, activación génica). Este enfoque experimental mide la interacción física directa entre proteínas y se denomina método binario.

Purificación por afinidad acoplada a espectrometría de masas

La purificación por afinidad de complejos proteicos acoplados a espectrometría de masas se lleva a cabo de la siguiente manera: se manipula una proteína específica (el cebo) para expresar una etiqueta de afinidad. La etiqueta sirve como herramienta para purificar la proteína cebo y las proteínas asociadas mediante cromatografía de afinidad. Los complejos proteicos purificados se resuelven luego en geles nativos y las bandas de proteínas discretas se escinden y digieren en pequeños fragmentos peptídicos mediante tripsina.

Los péptidos se identifican mediante métodos de espectrometría de masas. La identidad de la proteína asociada con una proteína cebo dada se determina comparando su huella peptídica con las bases de datos disponibles. Este método permite la identificación y cuantificación de parejas de unión directa y proteínas secundarias que interactúan, y las asigna a redes de proteínas. Este enfoque experimental mide las interacciones físicas entre grupos de proteínas sin distinguir si son directas o indirectas y se denomina método cocomplejo. Los resultados obtenidos de experimentos binarios y cocomplejos se documentan en una base de datos. Hay muchas bases de datos accesibles en línea que permiten agrupar proteínas por función y naturaleza de interacción y proporcionan un marco rico para la investigación biomédica.

Figura: El método de dos híbridos de levadura: Principio del método de cebo y presa para el estudio de la interacción proteína-proteína.

Puntos Clave

• Una pregunta clave sobre una proteína, además de cuándo y dónde se expresa, ¿con qué otras proteínas interactúa?
• Los socios de interacción son una ventaja inmediata hacia la función biológica y potencialmente pueden ser explotados con fines terapéuticos.
• La creación de un mapa de interacción proteína-proteína de la célula sería de inmenso valor para comprender la biología de la célula.
• Los enfoques más comunes utilizados para identificar las interacciones proteína-proteína son el sistema de dos híbridos de levadura y la purificación por afinidad acoplada a la espectrometría de masas.

Términos Clave

• Cromatografía de afinidad: Método de separación de una mezcla bioquímica basada en interacciones altamente específicas.
• Espectrometría de masas: Método analítico que permite ionizar moléculas y clasificarlas según su masa y carga.