12.2: Visualizar y caracterizar el ADN

Objetivos de aprendizaje

• Explicar el uso de sondas de ácido nucleico para visualizar secuencias de ADN específicas
• Explicar el uso de la electroforesis en gel para separar fragmentos de ADN
• Explicar el principio del análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción y sus usos
• Compara y contrasta transferencias sureñas y norteñas
• Explicar los principios y usos del análisis de microarrays
• Describir los métodos utilizados para separar y visualizar variantes de proteínas
• Explicar el método y usos de la reacción en cadena de la polimerasa y secuenciación del ADN

La secuencia de una molécula de ADN puede ayudarnos a identificar un organismo cuando se compara con secuencias conocidas alojadas en una base de datos. La secuencia también puede decirnos algo sobre la función de una parte particular del ADN, como si codifica una proteína en particular. Comparar las firmas de proteínas, los niveles de expresión de matrices específicas de proteínas, entre muestras es un método importante para evaluar las respuestas celulares a una multitud de factores ambientales y estreses. El análisis de las firmas proteicas puede revelar la identidad de un organismo o cómo responde una célula durante la enfermedad.

El ADN y las proteínas de interés son microscópicas y normalmente se mezclan con muchas otras moléculas, incluyendo ADN o proteínas irrelevantes para nuestros intereses. Se han desarrollado muchas técnicas para aislar y caracterizar moléculas de interés. Estos métodos fueron desarrollados originalmente con fines de investigación, pero en muchos casos se han simplificado hasta el punto de que el uso clínico rutinario es posible. Por ejemplo, muchos patógenos, como la bacteria Helicobacter pylori, que causa úlceras estomacales, pueden detectarse mediante pruebas basadas en proteínas. Además, un número creciente de ensayos de identificación basados en amplificación de ADN altamente específicos y precisos ahora pueden detectar patógenos como bacterias entéricas resistentes a antibióticos, virus del herpes simple, virus varicela-zóster y muchos otros.

Análisis Molecular de ADN

En esta subsección, esbozaremos algunos de los métodos básicos utilizados para separar y visualizar fragmentos específicos de ADN que son de interés para un científico. Algunos de estos métodos no requieren el conocimiento de la secuencia completa de la molécula de ADN. Antes del advenimiento de la secuenciación rápida del ADN, estos métodos eran los únicos disponibles para trabajar con el ADN, pero aún forman el arsenal básico de herramientas utilizadas por los genetistas moleculares para estudiar las respuestas del cuerpo a las enfermedades microbianas y otras enfermedades.

Sondeo de ácido nucleico

Las moléculas de ADN son pequeñas y la información contenida en su secuencia es invisible. ¿Cómo aísla un investigador un tramo particular de ADN, o habiéndolo aislado, determina de qué organismo es, cuál es su secuencia o cuál es su función? Un método para identificar la presencia de una determinada secuencia de ADN utiliza piezas de ADN construidas artificialmente llamadas sondas. Las sondas se pueden usar para identificar diferentes especies bacterianas en el ambiente y ahora hay muchas sondas de ADN disponibles para detectar patógenos clínicamente. Por ejemplo, se utilizan sondas de ADN para detectar los patógenos vaginales Candida albicans, Gardnerella vaginalis y Trichomonas vaginalis.

Para seleccionar una biblioteca genómica en busca de un gen o secuencia de interés en particular, los investigadores deben saber algo sobre ese gen. Si los investigadores tienen una porción de la secuencia de ADN para el gen de interés, pueden diseñar una sonda de ADN, un fragmento de ADN monocatenario que es complementario a parte del gen de interés y diferente de otras secuencias de ADN en la muestra. La sonda de ADN puede sintetizarse químicamente por laboratorios comerciales, o puede crearse clonando, aislando y desnaturalizando un fragmento de ADN de un organismo vivo. En cualquier caso, la sonda de ADN debe marcarse con una etiqueta molecular o baliza, como un átomo de fósforo radiactivo (como se usa para la autorradiografía) o un colorante fluorescente (como se usa en la hibridación fluorescente in situ, o FISH), de manera que se pueda ver la sonda y el ADN al que se une (Figura \(\PageIndex{1}\)). La muestra de ADN que se sondea también debe desnaturalizarse para hacerla monocatenaria de manera que la sonda de ADN monocatenario pueda hibridarse con la muestra de ADN monocatenario en lugares donde sus secuencias son complementarias. Si bien estas técnicas son valiosas para el diagnóstico, su uso directo en esputo y otras muestras corporales puede ser problemático debido a la naturaleza compleja de estas muestras. A menudo, el ADN debe aislarse primero de muestras corporales a través de métodos de extracción química antes de que una sonda de ADN pueda usarse para identificar patógenos.

Figura\(\PageIndex{1}\): Se pueden utilizar sondas de ADN para confirmar la presencia de un presunto patógeno en muestras de pacientes. Este diagrama ilustra cómo se puede utilizar una sonda de ADN para buscar un gen de interés asociado con el patógeno sospechoso.

Enfoque Clínico: Parte 2

Los síntomas leves similares a los de la gripe que Kayla está experimentando podrían ser causados por cualquier número de agentes infecciosos. Además, varias afecciones autoinmunes no infecciosas, como la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso sistémico (LES) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), también presentan síntomas que son consistentes con los primeros síntomas de Kayla. No obstante, en el transcurso de varias semanas, los síntomas de Kayla empeoraron. Comenzó a experimentar dolor articular en sus rodillas, palpitaciones cardíacas y una extraña flacidez en sus músculos faciales. Además, padecía rigidez en el cuello y dolores de cabeza dolorosos. De mala gana, decidió que era hora de buscar atención médica.

Ejercicio\(\PageIndex{1}\)

1. ¿Los nuevos síntomas de Kayla proporcionan alguna pista sobre qué tipo de infección u otra afección médica puede tener?
2. ¿Qué pruebas o herramientas podría usar un proveedor de atención médica para identificar el patógeno que causa los síntomas de Kayla?

Electroforesis en gel de agarosa

Hay una serie de situaciones en las que un investigador podría querer separar físicamente una colección de fragmentos de ADN de diferentes tamaños. Un investigador también puede digerir una muestra de ADN con una enzima de restricción para formar fragmentos. El tamaño resultante y el patrón de distribución de fragmentos a menudo pueden proporcionar información útil sobre la secuencia de bases de ADN que se pueden usar, al igual que un escaneo de código de barras, para identificar el individuo o especie a la que pertenece el ADN.

La electroforesis en gel es una técnica comúnmente utilizada para separar moléculas biológicas en función del tamaño y las características bioquímicas, como la carga y la polaridad. La electroforesis en gel de agarosa es ampliamente utilizada para separar ADN (o ARN) de diferentes tamaños que pueden generarse por digestión con enzimas de restricción o por otros medios, como la PCR (Figura\(\PageIndex{2}\)).

Debido a su cadena principal cargada negativamente, el ADN es fuertemente atraído por un electrodo positivo. En la electroforesis en gel de agarosa, el gel se orienta horizontalmente en una solución tampón. Las muestras se cargan en pocillos de muestra en el lado del gel más cercano al electrodo negativo, luego se extraen a través del tamiz molecular de la matriz de agarosa hacia el electrodo positivo. La matriz de agarosa impide el movimiento de moléculas más grandes a través del gel, mientras que las moléculas más pequeñas pasan más fácilmente. Así, la distancia de migración se correlaciona inversamente con el tamaño del fragmento de ADN, con fragmentos más pequeños viajando una distancia mayor a través del gel. Los tamaños de los fragmentos de ADN dentro de una muestra pueden estimarse en comparación con fragmentos de tamaño conocido en una escalera de ADN que también se ejecutan en el mismo gel. Para separar fragmentos de ADN muy grandes, como cromosomas o genomas virales, se puede modificar la electroforesis en gel de agarosa alternando periódicamente la orientación del campo eléctrico durante la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). En PFGE, los fragmentos más pequeños pueden reorientarse y migrar ligeramente más rápido que los fragmentos más grandes y esta técnica puede servir para separar fragmentos muy grandes que de otro modo viajarían juntos durante la electroforesis en gel de agarosa estándar. En cualquiera de estas técnicas de electroforesis, las localizaciones de los fragmentos de ADN o ARN en el gel pueden ser detectadas por diversos métodos. Un método común es agregar bromuro de etidio, una tinción que se inserta en los ácidos nucleicos en ubicaciones no específicas y puede visualizarse cuando se expone a la luz ultravioleta. Otras manchas que son más seguras que el bromuro de etidio, un potencial carcinógeno, ya están disponibles.

Figura\(\PageIndex{2}\): (a) El proceso de electroforesis en gel de agarosa. b) Un investigador cargando muestras en un gel. (c) Esta fotografía muestra una electroforesis terminada en un gel de agarosa. La escalera de ADN se encuentra en los carriles 1 y 9. Siete muestras se localizan en los carriles 2 a 8. El gel se tiñó con bromuro de etidio y se fotografió bajo luz ultravioleta. (crédito a: modificación de obra de Magnus Manske; crédito b: modificación de obra por parte del Departamento de Agricultura de Estados Unidos; crédito c: modificación de obra de James Jacob)

Análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)

Los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son cortos (de solo unos pocos nucleótidos de longitud), palíndromes específicos de secuencia, y pueden encontrarse en todo el genoma. Así, las diferencias en las secuencias de ADN en los genomas de los individuos conducirán a diferencias en la distribución de sitios de restricción y reconocimiento enzimático que pueden visualizarse como patrones de bandas distintos en un gel después de la electroforesis en gel de agarosa. El análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) compara patrones de bandas de ADN de diferentes muestras de ADN después de la digestión de restricción (Figura\(\PageIndex{3}\)).

El análisis RFLP tiene muchas aplicaciones prácticas tanto en medicina como en ciencia forense. Por ejemplo, los epidemiólogos utilizan el análisis RFLP para rastrear e identificar la fuente de microorganismos específicos implicados en brotes de intoxicación alimentaria o ciertas enfermedades infecciosas. El análisis RFLP también se puede utilizar en el ADN humano para determinar patrones de herencia de cromosomas con genes variantes, incluyendo aquellos asociados con enfermedades hereditarias o para establecer paternidad.

Los científicos forenses utilizan el análisis RFLP como forma de huellas dactilares de ADN, lo cual es útil para analizar el ADN obtenido de escenas del crimen, sospechosos y víctimas. Se recolectan muestras de ADN, se incrementa el número de copias de las moléculas de ADN de la muestra mediante PCR, y luego se someten a digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa para generar patrones específicos de bandas. Al comparar los patrones de bandas de muestras recolectadas de la escena del crimen con las recolectadas de sospechosos o víctimas, los investigadores pueden determinar definitivamente si las pruebas de ADN recolectadas en el lugar fueron dejadas atrás por sospechosos o víctimas.

Figura\(\PageIndex{3}\): El análisis RFLP se puede utilizar para diferenciar secuencias de ADN. En este ejemplo, un cromosoma normal se digiere en dos fragmentos, mientras que la digestión de un cromosoma mutado produce solo un fragmento. Las pequeñas flechas rojas que apuntan a los dos segmentos cromosómicos diferentes muestran las ubicaciones de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Después de la digestión y electroforesis en gel de agarosa, los patrones de bandas reflejan el cambio al mostrar la pérdida de dos bandas más cortas y la ganancia de una banda más larga. (crédito: modificación de obra por parte del Centro Nacional de Información Biotecnológica)

Southern Blots y Modificaciones

Varias técnicas moleculares capitalizan la complementariedad de secuencias y la hibridación entre ácidos nucleicos de una muestra y sondas de ADN. Típicamente, sondear muestras de ácido nucleico dentro de un gel no tiene éxito porque a medida que la sonda de ADN se empapa en un gel, los ácidos nucleicos de la muestra dentro del gel se difunden. Por lo tanto, las técnicas de transferencia se utilizan comúnmente para transferir ácidos nucleicos a una membrana delgada con carga positiva hecha de nitrocelulosa o nylon. En la técnica de transferencia Southern, desarrollada por Sir Edwin Southern en 1975, los fragmentos de ADN dentro de una muestra se separan primero por electroforesis en gel de agarosa y luego se transfieren a una membrana por acción capilar (Figura\(\PageIndex{4}\)). Los fragmentos de ADN que se unen a la superficie de la membrana se exponen luego a una sonda de ADN monocatenaria específica marcada con una baliza molecular radiactiva o fluorescente para ayudar en la detección. Las manchas Southern se pueden usar para detectar la presencia de ciertas secuencias de ADN en una muestra de ADN dada. Una vez visualizado el ADN diana dentro de la membrana, los investigadores pueden cortar la porción de la membrana que contiene el fragmento para recuperar el fragmento de ADN de interés.

Figura\(\PageIndex{4}\): En la técnica de transferencia Southern, los fragmentos de ADN se separan primero por electroforesis en gel de agarosa, luego se transfieren por acción capilar a una membrana de nylon, que luego se empapa con una sonda de ADN etiquetada con una baliza molecular para facilitar la visualización.

Las variaciones de la transferencia Southern (dot blot, slot blot y spot blot) no implican electroforesis, sino que concentran el ADN de una muestra en una pequeña ubicación en una membrana. Después de la hibridación con una sonda de ADN, se mide la intensidad de la señal detectada, lo que permite al investigador estimar la cantidad de ADN diana presente dentro de la muestra.

Una transferencia de colonias es otra variación de la transferencia Southern en la que colonias que representan diferentes clones en una biblioteca genómica se transfieren a una membrana presionando la membrana sobre la placa de cultivo. Las células en la membrana se lisan y la membrana se puede sondear para determinar qué colonias dentro de una biblioteca genómica albergan el gen diana. Debido a que las colonias en la placa siguen creciendo, las células de interés pueden aislarse de la placa.

En la transferencia northern, otra variación de la transferencia Southern, el ARN (no ADN) se inmoviliza en la membrana y se sondea. Las manchas Northern se utilizan típicamente para detectar la cantidad de ARNm producida a través de la expresión génica dentro de una muestra de tejido u organismo.

Análisis de micromatrices

Otra técnica que capitaliza la hibridación entre secuencias de ácidos nucleicos complementarias se llama análisis de micromatrices. El análisis de micromatrices es útil para la comparación de patrones de expresión génica entre diferentes tipos de células, por ejemplo, células infectadas con un virus frente a células no infectadas, o células cancerosas frente a células sanas (Figura\(\PageIndex{5}\)).

Típicamente, el ADN o ADNc de una muestra experimental se deposita en un portaobjetos de vidrio junto con secuencias de ADN conocidas. Cada portaobjetos puede contener más de 30,000 tipos de fragmentos de ADN diferentes. Distintos fragmentos de ADN (que abarcan toda la biblioteca genómica de un organismo) o fragmentos de ADNc (correspondientes al complemento completo de genes expresados de un organismo) se pueden manchar individualmente en un portaobjetos de vidrio.

Una vez depositado en el portaobjetos, se puede aislar ADN genómico o ARNm de las dos muestras para su comparación. Si se aísla el ARNm, se transcribe inversamente a ADNc usando transcriptasa inversa. Luego las dos muestras de ADN genómico o ADNc se marcan con diferentes colorantes fluorescentes (típicamente rojo y verde). Las muestras de ADN genómico marcadas se combinan en cantidades iguales, se agregan al chip de micromatriz y se dejan hibridar con puntos complementarios en la micromatriz.

La hibridación de las moléculas de ADN genómico de muestra se puede monitorear midiendo la intensidad de fluorescencia en puntos particulares en la micromatriz. Se pueden observar fácilmente diferencias en la cantidad de hibridación entre las muestras. Si solo los ácidos nucleicos de una muestra se hibridan con un punto particular en la micromatriz, entonces esa mancha aparecerá verde o roja. Sin embargo, si los ácidos nucleicos de ambas muestras hibridan, entonces la mancha aparecerá amarilla debido a la combinación de los colorantes rojo y verde.

Aunque la tecnología de microarreglos permite una comparación holística entre dos muestras en poco tiempo, requiere equipos de detección sofisticados (y costosos) y software de análisis. Debido al gasto, esta tecnología generalmente se limita a entornos de investigación. Los investigadores han utilizado el análisis de microarrays para estudiar cómo se ve afectada la expresión génica en organismos que están infectados por bacterias o virus o sometidos a ciertos tratamientos químicos.

Figura\(\PageIndex{5}\): (a) Se ilustran los pasos en el análisis de micromatrices. Aquí, los patrones de expresión génica se comparan entre células cancerosas y células sanas. (b) La información de micromatrices se puede expresar como un mapa de calor. Los genes se muestran en el lado izquierdo; diferentes muestras se muestran en la parte inferior. Los genes expresados solo en células cancerosas se muestran en diferentes tonos de rojo; los genes expresados solo en células normales se muestran en diferentes tonos de verde. Los genes que se expresan tanto en células cancerosas como normales se muestran en amarillo.

Enlace al aprendizaje

Explore la tecnología de microchips en este sitio web interactivo.

Ejercicio\(\PageIndex{2}\)

1. ¿En qué consiste una sonda de ADN?
2. ¿Por qué se usa una transferencia Southern después de la electroforesis en gel de una digestión de ADN?

Análisis Molecular de Proteínas

En muchos casos puede no ser deseable o posible estudiar ADN o ARN directamente. Las proteínas pueden proporcionar información específica de la especie para su identificación, así como información importante sobre cómo y si una célula o tejido está respondiendo a la presencia de un microorganismo patógeno. Diversas proteínas requieren diferentes métodos de aislamiento y caracterización.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Una variación de la electroforesis en gel, llamada electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), se usa comúnmente para separar proteínas. En PAGE, la matriz de gel es más fina y está compuesta por poliacrilamida en lugar de agarosa. Adicionalmente, PAGE se realiza típicamente usando un aparato de gel vertical (Figura\(\PageIndex{6}\)). Debido a las diferentes cargas asociadas con las cadenas laterales de aminoácidos, PAGE se puede usar para separar proteínas intactas en función de sus cargas netas. Alternativamente, las proteínas se pueden desnaturalizar y recubrir con un detergente cargado negativamente llamado dodecilsulfato de sodio (SDS), enmascarando las cargas nativas y permitiendo la separación basada únicamente en el tamaño. La PAGE se puede modificar adicionalmente para separar proteínas en base a dos características, tales como sus cargas a diversos pH así como su tamaño, mediante el uso de PAGE bidimensional. En cualquiera de estos casos, después de la electroforesis, las proteínas se visualizan a través de tinción, comúnmente con azul de Coomassie o una tinción plateada.

Figura\(\PageIndex{6}\): (a) El SDS es un detergente que desnaturaliza las proteínas y enmascara sus cargas nativas, haciéndolas uniformemente cargadas negativamente. b) En estas etapas se ilustra el proceso de SDS-PAGE. (c) Una fotografía de un gel SDS-PAGE muestra bandas teñidas de Coomassie donde proteínas de diferente tamaño han migrado a lo largo del gel en respuesta al voltaje aplicado. Un carril estándar de tamaño es visible en el lado derecho del gel. (crédito b: modificación de obra por “GeneEd” /YouTube)

Ejercicio\(\PageIndex{3}\)

¿En qué base se separan las proteínas en SDS-PAGE?

Enfoque Clínico: Parte 3

Cuando Kayla describió sus síntomas, su médico al principio sospechó meningitis bacteriana, lo que concuerda con sus dolores de cabeza y rigidez en el cuello. No obstante, pronto descartó esto como una posibilidad porque la meningitis suele progresar más rápidamente de lo que Kayla estaba experimentando. Muchos de sus síntomas aún eran similares a los de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y el lupus eritematoso sistémico (LES), y el médico también consideró la enfermedad de Lyme una posibilidad dada la cantidad de tiempo que Kayla pasa en el bosque. Kayla no recordó ninguna picadura de garrapata reciente (el medio típico por el que se transmite la enfermedad de Lyme) y no tenía la típica erupción de ojo de buey asociada con la enfermedad de Lyme (Figura\(\PageIndex{7}\)). Sin embargo, entre el 20 y el 30% de los pacientes con enfermedad de Lyme nunca desarrollan este sarpullido, por lo que el médico no quiso descartarlo.

El médico de Kayla ordenó una resonancia magnética de su cerebro, un hemograma completo para detectar anemia, análisis de sangre para evaluar la función hepática y renal, y pruebas adicionales para confirmar o descartar LES o enfermedad de Lyme. Sus resultados fueron inconsistentes tanto con LES como con ELA, y el resultado de la prueba en busca de anticuerpos contra la enfermedad de Lyme fue “equívoco”, lo que significa no concluyente. Habiendo descartado ELA y LES, el médico de Kayla decidió realizar pruebas adicionales para la enfermedad de Lyme.

Ejercicio\(\PageIndex{4}\)

1. ¿Por qué el médico de Kayla aún sospecharía la enfermedad de Lyme aunque los resultados de la prueba no detectaran anticuerpos de Lyme en la sangre?
2. ¿Qué tipo de prueba molecular podría utilizarse para la detección de anticuerpos sanguíneos contra la enfermedad de Lyme?

Figura\(\PageIndex{7}\): Una erupción de ojo de buey es uno de los síntomas comunes de las enfermedades de Lyme, pero hasta el 30% de los individuos infectados nunca desarrollan una erupción. (crédito: Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades)

Métodos de análisis de ADN basados en amplificación

Se pueden utilizar diversos métodos para obtener secuencias de ADN, que son útiles para el estudio de organismos causantes de enfermedades. Con el advenimiento de la tecnología de secuenciación rápida, nuestra base de conocimiento de todos los genomas de organismos patógenos ha crecido fenomenalmente. Comenzamos con una descripción de la reacción en cadena de la polimerasa, que no es un método de secuenciación sino que ha permitido a investigadores y médicos obtener las grandes cantidades de ADN necesarias para la secuenciación y otros estudios. La reacción en cadena de la polimerasa elimina la dependencia que alguna vez tuvimos de las células para hacer múltiples copias de ADN, logrando el mismo resultado a través de reacciones relativamente simples fuera de la célula.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La mayoría de los métodos de análisis de ADN, como la digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa, o la secuenciación de ADN requieren grandes cantidades de un fragmento de ADN específico. En el pasado, se producían grandes cantidades de ADN cultivando las células hospedadoras de una biblioteca genómica. Sin embargo, las bibliotecas requieren tiempo y esfuerzo para prepararse y las muestras de ADN de interés a menudo vienen en cantidades diminutas. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite una rápida amplificación en el número de copias de secuencias específicas de ADN para su posterior análisis (Figura\(\PageIndex{8}\)). Una de las técnicas más poderosas en biología molecular, la PCR fue desarrollada en 1983 por Kary Mullis mientras estaba en Cetus Corporation. La PCR tiene aplicaciones específicas en laboratorios de investigación, forenses y clínicos, incluyendo:

• determinar la secuencia de nucleótidos en una región específica de ADN
• amplificar una región diana de ADN para clonar en un vector plasmídico
• identificar la fuente de una muestra de ADN dejada en la escena del crimen
• analizar muestras para determinar la paternidad
• comparar muestras de ADN antiguo con organismos modernos
• determinar la presencia de microorganismos difíciles de cultivar, o incultivables, en humanos o muestras ambientales

La PCR es una técnica de laboratorio in vitro que aprovecha el proceso natural de replicación del ADN. Las enzimas ADN polimerasa termoestables utilizadas en la PCR se derivan de procariotas hipertermófilos. La ADN polimerasa Taq, comúnmente utilizada en PCR, se deriva de la bacteria Thermus aquaticus aislada de una fuente termal en el Parque Nacional Yellowstone. La replicación del ADN requiere el uso de cebadores para el inicio de la replicación para tener grupos 3"-hidroxilo libres disponibles para la adición de nucleótidos por la ADN polimerasa. Sin embargo, mientras que los cebadores compuestos por ARN se utilizan normalmente en las células, los cebadores de ADN se utilizan para la PCR. Los cebadores de ADN son preferibles debido a su estabilidad, y los cebadores de ADN con secuencias conocidas que se dirigen a una región de ADN específica pueden sintetizarse químicamente comercialmente. Estos cebadores de ADN son funcionalmente similares a las sondas de ADN utilizadas para las diversas técnicas de hibridación descritas anteriormente, uniéndose a dianas específicas debido a la complementariedad entre la secuencia de ADN diana y el cebador.

La PCR ocurre a lo largo de múltiples ciclos, cada uno de los cuales contiene tres etapas: desnaturalización, hibridación y extensión. Para PCR se utilizan máquinas llamadas termocicladoras; estas máquinas pueden programarse para que circulen automáticamente a través de las temperaturas requeridas en cada paso (Figura 12.1). Primero, el ADN molde bicatenario que contiene la secuencia diana se desnaturaliza a aproximadamente 95 °C. La alta temperatura requerida para separar físicamente (en lugar de enzimáticamente) las cadenas de ADN es la razón por la que se requiere la ADN polimerasa termoestable. A continuación, la temperatura se baja a aproximadamente 50 °C, lo que permite que los cebadores de ADN complementarios a los extremos de la secuencia diana se hibriden (se peguen) a las cadenas molde, con un cebador que se hibrida a cada hebra. Finalmente, la temperatura se eleva a 72 °C, la temperatura óptima para la actividad de la ADN polimerasa termoestable, permitiendo la adición de nucleótidos al cebador utilizando la diana monocatenaria como molde. Cada ciclo duplica el número de copias de ADN diana bicatenario. Por lo general, los protocolos de PCR incluyen de 25 a 40 ciclos, lo que permite la amplificación de una sola secuencia diana en decenas de millones a más de un billón.

La replicación natural del ADN está diseñada para copiar todo el genoma e inicia en uno o más sitios de origen. Los cebadores se construyen durante la replicación, no antes, y no consisten en algunas secuencias específicas. La PCR se dirige a regiones específicas de una muestra de ADN usando cebadores específicos de secuencia. En los últimos años, se han desarrollado una variedad de métodos isotérmicos de amplificación por PCR que eluden la necesidad de ciclos térmicos, aprovechando las proteínas accesorias que ayudan en el proceso de replicación del ADN. A medida que el desarrollo de estos métodos continúa y su uso se generaliza en los laboratorios de investigación, forenses y clínicos, los termocicladores pueden quedar obsoletos.

Figura\(\PageIndex{8}\): La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para producir muchas copias de una secuencia específica de ADN.

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Profundiza tu comprensión de la reacción en cadena de la polimerasa viendo esta animación y trabajando a través de un ejercicio interactivo.

Variaciones PCR

Varias modificaciones posteriores a la PCR incrementan aún más la utilidad de esta técnica. La PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) se utiliza para obtener copias de ADN de una molécula de ARNm específica. La RT-PCR comienza con el uso de la enzima transcriptasa inversa para convertir moléculas de ARNm en ADNc. Ese ADNc se usa entonces como molde para la amplificación por PCR tradicional. La RT-PCR puede detectar si un gen específico se ha expresado en una muestra. Otra aplicación reciente de la PCR es la PCR en tiempo real, también conocida como PCR cuantitativa (qPCR). Los protocolos estándar de PCR y RT-PCR no son cuantitativos porque cualquiera de los reactivos puede llegar a ser limitante antes de que se completen todos los ciclos dentro del protocolo, y las muestras solo se analizan al final. Debido a que no es posible determinar cuándo en el protocolo PCR o RT-PCR un reactivo dado se ha vuelto limitante, no es posible saber cuántos ciclos se completaron antes de este punto, y por lo tanto no es posible determinar cuántas moléculas molde originales estaban presentes en la muestra al inicio de PCR. En qPCR, sin embargo, el uso de fluorescencia permite monitorear el aumento en un molde bicatenario durante una reacción de PCR a medida que ocurre. Estos datos cinéticos se pueden usar entonces para cuantificar la cantidad de la secuencia diana original. El uso de qPCR en los últimos años ha ampliado aún más las capacidades de la PCR, permitiendo a los investigadores determinar el número de copias de ADN, y a veces organismos, presentes en una muestra. En entornos clínicos, se utiliza qRT-PCR para determinar la carga viral en pacientes VIH positivos para evaluar la efectividad de su terapia.

Secuenciación de ADN

Una técnica básica de secuenciación es el método de terminación de cadena, también conocido como método didesoxilo o método de secuenciación de ADN de Sanger, desarrollado por Frederick Sanger en 1972. El método de terminación de cadena implica la replicación de ADN de un molde monocatenario con el uso de un cebador de ADN para iniciar la síntesis de una cadena complementaria, ADN polimerasa, una mezcla de los cuatro monómeros de desoxinucleótidos regulares (dNTP) y una pequeña proporción de didesoxinucleótidos (ddNTPs), cada uno marcado con un baliza molecular. Los ddNTPs son monómeros que carecen de un grupo hidroxilo (-OH) en el sitio en el que normalmente se une otro nucleótido para formar una cadena (Figura\(\PageIndex{9}\)). Cada vez que un ddNTP se incorpora aleatoriamente en la cadena complementaria en crecimiento, termina el proceso de replicación del ADN para esa cadena en particular. Esto da como resultado múltiples cadenas cortas de ADN replicado que terminan cada una en un punto diferente durante la replicación. Cuando la mezcla de reacción se somete a electroforesis en gel, las múltiples cadenas de ADN recién replicadas forman una escalera de diferentes tamaños. Debido a que los ddNTPs están marcados, cada banda en el gel refleja el tamaño de la cadena de ADN cuando el ddNTP terminó la reacción.

En el día de Sanger, se establecieron cuatro reacciones por cada molécula de ADN secuenciada, conteniendo cada reacción solo uno de los cuatro posibles ddNTPs. Cada ddNTP se marcó con una molécula de fósforo radiactivo. Los productos de las cuatro reacciones se ejecutaron en carriles separados uno al lado del otro en geles PAGE largos y estrechos, y las bandas de longitudes variables se detectaron por autoradiografía. Hoy en día, este proceso se ha simplificado con el uso de ddNTPs, cada uno marcado con un colorante fluorescente de diferente color o fluorocromo (Figura\(\PageIndex{10}\)), en una reacción de secuenciación que contiene los cuatro ddNTPs posibles para cada molécula de ADN que se está secuenciando (Figura\(\PageIndex{11}\)). Estos fluorocromos se detectan por espectroscopía de fluorescencia. Determinar el color de fluorescencia de cada banda a medida que pasa por el detector produce la secuencia de nucleótidos de la cadena molde.

Figura\(\PageIndex{9}\): Un didesoxinucleótidos es similar en estructura a un desoxinucleótidos, pero le falta el grupo hidroxilo 3' (indicado por la caja sombreada). Cuando se incorpora un didesoxinucleótidos a una cadena de ADN, la síntesis de ADN se detiene.

Figura\(\PageIndex{10}\): Se ilustra el método de terminación de cadena didesoxica de Frederick Sanger, usando ddNTPs etiquetados con fluorocromos. Usando ddNTPs, se puede generar una mezcla de fragmentos de ADN de todos los tamaños posibles, que varían en longitud en un solo nucleótido. El ADN se separa en base al tamaño y cada banda se puede detectar con un detector de fluorescencia.

Figura\(\PageIndex{11}\): Este diagrama resume el método de secuenciación de Sanger utilizando ddNTPs marcados con fluorocromo y electroforesis capilar en gel.

Desde 2005, las técnicas de secuenciación automatizada utilizadas por los laboratorios caen bajo el paraguas de la secuenciación de próxima generación, que es un grupo de técnicas automatizadas utilizadas para la secuenciación rápida del ADN. Estos métodos han revolucionado el campo de la genética molecular porque los secuenciadores de bajo costo pueden generar secuencias de cientos de miles o millones de fragmentos cortos (25 a 600 pares de bases) apenas en un día. Si bien varias variantes de las tecnologías de secuenciación de próxima generación son realizadas por diferentes compañías (por ejemplo, la pirosecuenciación de 454 Life Sciences y la tecnología Solexa de Illumina), todas permiten secuenciar millones de bases rápidamente, haciendo que la secuenciación de genomas completos sea relativamente fácil, económica, y lugar común. En la secuenciación 454 (pirosecuenciación), por ejemplo, una muestra de ADN se fragmenta en fragmentos monocatenarios de 400—600 pb, modificados con la adición de adaptadores de ADN a ambos extremos de cada fragmento. Luego, cada fragmento de ADN se inmoviliza en una perla y se amplifica por PCR, usando cebadores diseñados para hibridarse con los adaptadores, creando una perla que contiene muchas copias de ese fragmento de ADN. Cada perla se pone entonces en un pocillo separado que contiene enzimas de secuenciación. Al pozo, cada uno de los cuatro nucleótidos se agrega uno tras otro; cuando se incorpora cada uno, se libera pirofosfato como subproducto de la polimerización, emitiendo un pequeño destello de luz que es registrado por un detector. Esto proporciona el orden de nucleótidos incorporados a medida que se elabora una nueva cadena de ADN y es un ejemplo de secuenciación de síntesis. Los secuenciadores de próxima generación utilizan software sofisticado para superar el engorroso proceso de poner todos los fragmentos en orden. En general, estas tecnologías continúan avanzando rápidamente, disminuyendo el costo de secuenciación y aumentando rápidamente la disponibilidad de datos de secuencias de una amplia variedad de organismos.

El Centro Nacional de Información Biotecnológica alberga una base de datos de secuencias genéticas ampliamente utilizada llamada GenBank, donde los investigadores depositan información genética para uso público. Al publicar los datos de la secuencia, los investigadores los suben a GenBank, dando a otros investigadores acceso a la información. La colaboración permite a los investigadores comparar información de secuencias de muestras recién descubiertas o desconocidas con la amplia gama de datos de secuencia que ya existe.

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Vea una animación sobre la secuenciación 454 para profundizar en su comprensión de este método.

Uso de un NAAT para diagnosticar una infección por C. difficile

Javier, paciente de 80 años con antecedentes de cardiopatía, regresó recientemente a su hogar del hospital después de someterse a un procedimiento de angioplastia para insertar un stent en una arteria cardíaca. Para minimizar la posibilidad de infección, a Javier se le administraron antibióticos intravenosos de amplio espectro durante y poco después de su procedimiento. Fue dado de alta cuatro días después del procedimiento, pero una semana después, comenzó a experimentar calambres abdominales leves y diarrea acuosa varias veces al día. Perdió el apetito, se deshidrató severamente y desarrolló fiebre. También se percató de sangre en sus heces. La esposa de Javier llamó al médico, quien le indicó que lo llevara de inmediato a la sala de urgencias.

El personal del hospital realizó varias pruebas y encontró que los niveles de creatinina renal de Javier estaban elevados en comparación con los niveles en su sangre, lo que indica que sus riñones no funcionaban bien. Los síntomas de Javier sugirieron una posible infección por Clostridium difficile, una bacteria resistente a muchos antibióticos. El hospital recolectó y cultivó una muestra de heces para buscar la producción de toxinas A y B por C. difficile, pero los resultados fueron negativos. Sin embargo, los resultados negativos no fueron suficientes para descartar una infección por C. difficile porque el cultivo de C. difficile y la detección de sus toxinas características pueden ser difíciles, particularmente en algunos tipos de muestras. Para estar seguros, procedieron con una prueba diagnóstica de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT). Actualmente los NAAT son el estándar de oro del diagnosticador clínico para detectar el material genético de un patógeno. En el caso de Javier, se utilizó qPCR para buscar el gen que codifica la toxina B de C. difficile (tcdB). Cuando el análisis qPCR dio positivo, el médico tratante concluyó que Javier efectivamente padecía una infección por C. difficile e inmediatamente le recetó el antibiótico vancomicina, para ser administrado por vía intravenosa. El antibiótico aclaró la infección y Javier realizó una recuperación completa.

Debido a que las infecciones por C. difficile se generalizaban en la comunidad de Javier, su muestra fue analizada más a fondo para ver si se podía identificar la cepa específica de C. difficile. La muestra de heces de Javier se sometió a ribotipado y análisis de PCR repetitiva basada en secuencia (ReP-PCR). En el ribotipado, se amplifica una secuencia corta de ADN entre los genes de ARNr 16S y ARNr 23S y se somete a digestión de restricción (Figura\(\PageIndex{12}\)). Esta secuencia varía entre cepas de C. difficile, por lo que las enzimas de restricción cortarán en diferentes lugares. En Rep-PCR, se utilizaron para PCR cebadores de ADN diseñados para unirse a secuencias cortas que se encuentran comúnmente repetidas dentro del genoma de C. difficile. Después de la digestión de restricción, se realizó electroforesis en gel de agarosa en ambos tipos de análisis para examinar los patrones de bandas que resultaron de cada procedimiento (Figura\(\PageIndex{13}\)). ReP-PCR se puede utilizar para subtipar adicionalmente diversos ribotipos, aumentando la resolución para detectar diferencias entre cepas. Se encontró que el ribotipo de la cepa que infectó a Javier era el ribotipo 27, una cepa conocida por su mayor virulencia, resistencia a los antibióticos y mayor prevalencia en Estados Unidos, Canadá, Japón y Europa. ¹

Ejercicio\(\PageIndex{5}\)

1. ¿En qué se diferencian los patrones de bandas entre cepas de C. difficile?
2. ¿Por qué cree que las pruebas de laboratorio no pudieron detectar directamente la producción de toxinas?

Figura\(\PageIndex{12}\): Un gel que muestra productos de PCR de diversas cepas de Clostridium difficile. La muestra de Javier se muestra en la parte inferior; tenga en cuenta que coincide con el ribotipo 27 en el conjunto de referencia. (crédito: modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología)

Figura\(\PageIndex{13}\): Cepas de bacterias infecciosas, como C. difficile, pueden ser identificadas por análisis molecular. El ribotipado por PCR se usa comúnmente para identificar cepas particulares de C. difficile. ReP-PCR es una técnica molecular alternativa que también se utiliza para identificar cepas particulares de C. difficile. (crédito b: modificación del trabajo de la Sociedad Americana de Microbiología)

Ejercicio\(\PageIndex{6}\)

1. ¿Cómo es la PCR similar al proceso de replicación natural del ADN en las células? ¿En qué se diferencia?
2. Comparar RT-PCR y qPCR en términos de sus respectivos propósitos.
3. En la secuenciación de terminación de cadena, ¿cómo se determina la identidad de cada nucleótido en una secuencia?

Conceptos clave y resumen

• Encontrar un gen de interés dentro de una muestra requiere el uso de una sonda de ADN monocatenario marcada con una baliza molecular (típicamente radiactividad o fluorescencia) que pueda hibridarse con un ácido nucleico monocatenario complementario en la muestra.
• La electroforesis en gel de agarosa permite la separación de moléculas de ADN en función del tamaño.
• El análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) permite la visualización por electroforesis en gel de agarosa de distintas variantes de una secuencia de ADN causadas por diferencias en los sitios de restricción.
• El análisis de transferencia Southern permite a los investigadores encontrar una secuencia de ADN particular dentro de una muestra, mientras que el análisis de transferencia Northern permite a los investigadores detectar una secuencia de ARNm particular expresada en una muestra.
• La tecnología de micromatrices es una técnica de hibridación de ácidos nucleicos que permite el examen de muchos miles de genes a la vez para encontrar diferencias en genes o patrones de expresión génica entre dos muestras de ADN genómico o ADNc,
• La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) permite la separación de proteínas por tamaño, especialmente si las cargas proteicas nativas se enmascaran a través del pretratamiento con SDS.
• La reacción en cadena de la polimerasa permite la amplificación rápida de una secuencia de ADN específica. Las variaciones de PCR pueden usarse para detectar la expresión de ARNm (PCR de transcriptasa inversa) o para cuantificar una secuencia particular en la muestra original (PCR en tiempo real).
• Aunque el desarrollo de la secuenciación del ADN de Sanger fue revolucionario, los avances en la secuenciación de próxima generación permiten la secuenciación rápida y económica de los genomas de muchos organismos, acelerando el volumen de nuevos datos de secuencia.

Notas al pie

1. 1 Patrizia Spigaglia, Fabrizio Barbanti, Anna Maria Dionisi, y Paola Mastrantonio. “Aislamientos de Clostridium difficile Resistentes a Fluoroquinolonas en Italia: Emergencia del Ribotipo PCR 018.” Revista de Microbiología Clínica 48 núm. 8 (2010): 2892—2896.