20.2: Detección de Complejos Antigeno-Anticuerpo in vitro
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- Describir varios tipos de ensayos utilizados para encontrar complejos antígeno-anticuerpo
- Describir las circunstancias bajo las cuales los complejos antígeno-anticuerpo precipitan fuera de la solución
- Explicar cómo se pueden usar los anticuerpos en el suero del paciente para diagnosticar enfermedades
Las pruebas de laboratorio para detectar anticuerpos y antígenos fuera del cuerpo (por ejemplo, en un tubo de ensayo) se denominan ensayos in vitro. Cuando ambos anticuerpos y sus antígenos correspondientes están presentes en una solución, a menudo podemos observar una reacción de precipitación en la que se forman grandes complejos (celosías) y se asientan de la solución. En las siguientes secciones, discutiremos varios ensayos in vitro comunes.
Reacciones de Precipitin
Un complejo visible antígeno-anticuerpo se llama precipitina, y los ensayos in vitro que producen una precipitina se denominan reacciones de precipitina. Una reacción de precipitina implica típicamente añadir antígenos solubles a un tubo de ensayo que contiene una solución de anticuerpos. Cada anticuerpo tiene dos brazos, cada uno de los cuales puede unirse a un epítopo. Cuando un anticuerpo se une a dos antígenos, los dos antígenos se unen entre sí por el anticuerpo. Se puede formar una red a medida que los anticuerpos unen más y más antígenos entre sí, dando como resultado una precipitina (Figura\(\PageIndex{1}\)). La mayoría de las pruebas de precipitina utilizan antisuero policlonal en lugar de anticuerpos monoclonales porque los anticuerpos policlonales pueden unirse a múltiples epítopos, lo que hace que la formación de redes sea más probable. Aunque los mAbs pueden unirse a algunos antígenos, la unión ocurrirá con menos frecuencia, lo que hace que sea mucho menos probable que se forme una precipitina visible.
La cantidad de precipitación también depende de varios otros factores. Por ejemplo, la precipitación se potencia cuando los anticuerpos tienen una alta afinidad por el antígeno. Si bien la mayoría de los anticuerpos se unen al antígeno con alta afinidad, incluso la unión de alta afinidad utiliza enlaces no covalentes relativamente débiles, por lo que las interacciones individuales a menudo se romperán y se producirán nuevas interacciones.
Además, para que la formación de precipitina sea visible, debe haber una relación óptima de anticuerpo a antígeno. La relación óptima no es probable que sea una relación 1:1 antígeno-anticuerpo; puede variar drásticamente, dependiendo del número de epítopos en el antígeno y la clase de anticuerpo. Algunos antígenos pueden tener solo uno o dos epítopos reconocidos por el antisuero, mientras que otros antígenos pueden tener muchos epítopos diferentes y/o múltiples instancias del mismo epítopo en una sola molécula de antígeno.
La Figura\(\PageIndex{2}\) ilustra cómo la proporción de antígeno y anticuerpo afecta la cantidad de precipitación. Para lograr la relación óptima, el antígeno se agrega lentamente a una solución que contiene anticuerpos, y la cantidad de precipitina se determina cualitativamente. Inicialmente, no hay suficiente antígeno para producir formación de red visible; esto se llama la zona de exceso de anticuerpos. A medida que se agrega más antígeno, la reacción ingresa a la zona de equivalencia (o zona de equivalencia), donde se produce tanto la interacción óptima antígeno-anticuerpo como la precipitación máxima. Si se agregara aún más antígeno, la cantidad de antígeno se volvería excesiva y en realidad provocaría que la cantidad de precipitación disminuyera.
Ejercicio\(\PageIndex{1}\)
- ¿Qué es una precipitina?
- ¿Por qué los antisueros policlonales producen una mejor reacción de la precipitina?
Prueba de anillo de precipitin
Una variedad de técnicas nos permiten utilizar la formación de precipitina para cuantificar la concentración de antígeno o la cantidad de anticuerpo presente en un antisuero. Una de esas técnicas es la prueba del anillo de precipitina (Figura\(\PageIndex{3}\)), que se utiliza para determinar la cantidad relativa de anticuerpo específico de antígeno en una muestra de suero. Para realizar esta prueba, se prepara un conjunto de tubos de ensayo añadiendo una solución de antígeno al fondo de cada tubo. Cada tubo recibe el mismo volumen de solución, y la concentración de antígenos es constante (e.g., 1 mg/mL). A continuación, se agrega glicerol a la solución de antígeno en cada tubo de ensayo, seguido de una dilución en serie del antisuero. El glicerol evita la mezcla del antisuero con la solución de antígeno, permitiendo que la unión antígeno-anticuerpo tenga lugar solo en la interfaz de las dos soluciones. El resultado es un anillo visible de precipitina en los tubos que tienen una relación antígeno-anticuerpo dentro de la zona de equivalencia. Esta dilución más alta con un anillo visible se utiliza para determinar el título de los anticuerpos. El título es el recíproco de la dilución más alta mostrando un resultado positivo, expresado como un número entero. En la Figura\(\PageIndex{3}\), el título es 16.
Si bien una medición del título no nos dice en términos absolutos cuánto anticuerpo está presente, sí da una medida de la actividad biológica, que suele ser más importante que la cantidad absoluta. En este ejemplo, no sería útil saber qué masa de IgG estaban presentes en el antisuero, porque hay muchas especificidades diferentes de anticuerpo presentes; pero es importante para nosotros saber qué cantidad de la actividad del anticuerpo en el suero de un paciente se dirige contra el antígeno de interés (p. ej., un patógeno particular o alérgeno).
Ensayo de Ouchterlony
Si bien la prueba del anillo de precipitina proporciona información sobre las interacciones anticuerpo-antígeno, también tiene algunos inconvenientes. Requiere el uso de grandes cantidades de suero, y se debe tener mucho cuidado para evitar mezclar las soluciones e interrumpir el anillo. Realizar una prueba similar en una matriz de gel de agar puede minimizar estos problemas. Este tipo de ensayo se denomina diversamente doble inmunodifusión o el ensayo de Ouchterlony para Orjan Ouchterlony, 1 quien describió la técnica por primera vez en 1948.
Cuando el agar está altamente purificado, produce un gel transparente e incoloro. Se perforan agujeros en el gel para formar pocillos, y se agregan antígeno y antisueros a los pocillos vecinos. Las proteínas son capaces de difundirse a través del gel, y se forman arcos de precipitina entre los pocillos en la zona de equivalencia. Debido a que la celosía de precipitina es demasiado grande para difundirse a través del gel, los arcos están firmemente bloqueados en su lugar y son fáciles de ver (Figura\(\PageIndex{4}\)).
Aunque ahora existen métodos más sensibles y cuantitativos para detectar interacciones anticuerpo-antígeno, la prueba de Ouchterlony proporciona una forma rápida y cualitativa de determinar si un antisuero tiene anticuerpos contra un antígeno en particular. La prueba de Ouchterlony es particularmente útil cuando se busca reactividad cruzada. Podemos verificar un antisuero contra un grupo de antígenos estrechamente relacionados y ver qué combinaciones forman arcos de precipitina.
Ensayo de Inmunodifusión Radial
El ensayo de inmunodifusión radial (RID) es similar al ensayo de Ouchterlony pero se utiliza para cuantificar con precisión la concentración de antígeno en lugar de comparar diferentes antígenos. En este ensayo, el antisuero se agrega al agar templado (agar líquido a ligeramente por encima de 45 °C), el cual se vierte en una pequeña placa de Petri o sobre un portaobjetos de vidrio y se deja enfriar. Los pocillos se cortan en el agar enfriado, luego se agrega antígeno a los pocillos y se deja que se difunda. A medida que el antígeno y el anticuerpo interactúan, forman una zona de precipitación. El cuadrado del diámetro de la zona de precipitación es directamente proporcional a la concentración de antígeno. Al medir las zonas de precipitación producidas por muestras de concentración conocida (ver el anillo externo de muestras en la Figura\(\PageIndex{5}\)), podemos preparar una curva estándar para determinar la concentración de una solución desconocida. El ensayo RID es también una prueba útil para determinar la concentración de muchas proteínas séricas como las proteínas del complemento C3 y C4, entre otras.
Ejercicio\(\PageIndex{2}\)
- ¿Por qué se forma un anillo de precipitina en una prueba de anillo de precipitina y cuáles son algunas razones por las que podría no formarse un anillo?
- Comparar y contrastar las técnicas utilizadas en un ensayo de Ouchterlony y un ensayo de inmunodifusión radial.
Ensayos de Floculación
Un ensayo de floculación es similar a una reacción de precipitina excepto que involucra antígenos insolubles como lípidos. Un floculante es similar a una precipitina en que hay una red visible de antígeno y anticuerpo, pero debido a que los lípidos son insolubles en solución acuosa, no pueden precipitar. En lugar de precipitación, se observa floculación (espumación) en el fluido del tubo de ensayo.
Uso de la floculación para la prueba de sífilis
La sífilis es una infección de transmisión sexual que puede causar enfermedades graves y crónicas en adultos. Además, se transmite fácilmente de madres infectadas a sus recién nacidos durante el embarazo y el parto, lo que a menudo resulta en muerte fetal o graves problemas de salud a largo plazo para el lactante. Desafortunadamente, la sífilis también puede ser difícil de diagnosticar en mujeres embarazadas, porque a menudo es asintomática, especialmente en mujeres. Además, el agente causante, la bacteria Treponema pallidum, es difícil de cultivar en medios convencionales de laboratorio y demasiado pequeño para verlo mediante microcopia de rutina. Por estas razones, los diagnósticos presuntivos de sífilis generalmente se confirman indirectamente en el laboratorio mediante pruebas que detectan anticuerpos contra antígenos treponémicos.
En 1906, el científico alemán August von Wassermann (1866-1925) introdujo la primera prueba de sífilis que se basó en la detección de anticuerpos antitreponémicos en la sangre del paciente. Los anticuerpos detectados en la prueba de Wassermann fueron anticuerpos antifosfolípidos que son inespecíficos de T. pallidum. Su presencia puede ayudar en el diagnóstico de sífilis, pero por ser inespecíficas, también pueden conducir a resultados falsos positivos en pacientes con otras enfermedades y afecciones autoinmunes. La prueba original de Wasserman ha sido modificada a lo largo de los años para minimizar los falsos positivos y ahora se conoce como la prueba de Laboratorio de Investigación de Enfermedades Venerales, más conocida por sus siglas, la prueba VDRL.
Para realizar la prueba de VDRL, se coloca suero o líquido cefalorraquídeo del paciente sobre un portaobjetos con una mezcla de cardiolipina (fosfolípido antigénico que se encuentra en la membrana mitocondrial de diversos patógenos), lecitina y colesterol. La lecitina y el colesterol estabilizan la reacción y disminuyen los falsos positivos. Los anticuerpos anti-treponémicos del suero de un paciente infectado se unirán a cardiolipina y formarán un floculante. Aunque la prueba VDRL es más específica que el ensayo original de Wassermann, aún pueden ocurrir falsos positivos en pacientes con enfermedades autoinmunes que causan daño celular extenso (p. ej., lupus eritematoso sistémico).
Ensayo de neutralización
Para causar infección, los virus deben unirse a los receptores en las células hospedadoras. Los anticuerpos antivirales pueden neutralizar las infecciones virales recubriendo los viriones, bloqueando la unión (Figura 18.1.6). Esta actividad neutraliza los viriones y puede dar como resultado la formación de grandes complejos anticuerpo-virus (que se eliminan fácilmente por fagocitosis) o por unión de anticuerpos al virus y bloqueo de su unión a receptores de células hospedadoras. Esta actividad de neutralización es la base de los ensayos de neutralización, ensayos sensibles utilizados para el diagnóstico de infecciones virales.
Cuando los virus infectan a las células, a menudo causan daños (efectos citopáticos) que pueden incluir la lisis de las células hospedadoras. Los efectos citopáticos se pueden visualizar cultivando células hospedadoras en una placa de Petri, cubriendo las células con una fina capa de agar y luego agregando virus (ver Aislamiento, cultivo e identificación de virus). El virus se difundirá muy lentamente a través del agar. Un virus entrará en una célula hospedadora, proliferará (causando daño celular), se liberará de la célula hospedadora muerta y luego se moverá a las células vecinas. A medida que más y más células mueren, se formarán placas de células muertas (Figura\(\PageIndex{6}\)).
Durante el curso de una infección viral, el paciente montará una respuesta de anticuerpos al virus, y podemos cuantificar esos anticuerpos mediante un ensayo de reducción de placa. Para realizar el ensayo se realiza una dilución en serie sobre una muestra de suero. Cada dilución se mezcla luego con una cantidad estandarizada del virus sospechoso. Cualquier anticuerpo específico de virus en el suero neutralizará parte del virus. Las suspensiones se añaden luego a las células hospedadoras en cultivo para permitir que cualquier virus no neutralizado infecte las células y forme placas después de varios días. El título se define como el recíproco de la dilución más alta mostrando una reducción del 50% en las placas. El título siempre se expresa como un número entero. Por ejemplo, si una dilución 1/64 fue la dilución más alta para mostrar 50% de reducción de placa, entonces el título es 64.
La presencia de anticuerpos en el suero del paciente no nos indica si el paciente está actualmente infectado o si fue infectado en el pasado. Las infecciones actuales se pueden identificar esperando dos semanas y probando otra muestra de suero. Un aumento de cuatro veces en el título neutralizante en esta segunda muestra indica una nueva infección.
Ejercicio\(\PageIndex{3}\)
En un ensayo de neutralización, si el suero de un paciente tiene un alto número de anticuerpos antivirales, ¿esperaría ver más o menos placas?
Inmunoelectroforesis
Cuando un paciente tiene niveles elevados de proteínas en la sangre o está perdiendo proteína en la orina, un médico suele ordenar un ensayo de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) (ver Visualización y caracterización de ADN, ARN y proteínas). Este ensayo compara la abundancia relativa de los diversos tipos de proteínas séricas. Los patrones anormales de electroforesis de proteínas se pueden estudiar más a fondo mediante inmunoelectroforesis (IEP). El IEP comienza con la ejecución de una PAGE. Los antisueros contra proteínas séricas seleccionadas se agregan a canales que corren paralelos a la pista de electroforesis, formando arcos de precipitina similares a los observados en un ensayo de Ouchterlony (Figura\(\PageIndex{7}\)). Esto permite la identificación de proteínas inmunoglobulinas anormales en la muestra.
El IEP es particularmente útil en el diagnóstico de mieloma múltiple, un cáncer de células secretoras de anticuerpos. Los pacientes con mieloma múltiple no pueden producir anticuerpos sanos, sino que producen anticuerpos anormales que son proteínas monoclonales (proteínas M). Así, los pacientes con mieloma múltiple presentarán niveles elevados de proteína sérica que muestran una banda distinta en la región de la gammaglobulina de un gel de electroforesis proteica y un pico agudo (en proteína M) en la exploración del densitómetro en lugar del frotis ancho normal (Figura\(\PageIndex{7}\)). Cuando se utilizan anticuerpos contra los diversos tipos de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos para formar arcos de precipitina, la proteína M provocará arcos claramente sesgados contra una clase de cadena pesada y una clase de cadena ligera como se ve en la Figura\(\PageIndex{7}\).
Electroforesis de proteínas y caracterización de la estructura de la inmunoglobulina
El advenimiento de la electroforesis finalmente condujo a investigar y comprender la estructura de los anticuerpos. Cuando el bioquímico sueco Arne Tiselius (1902-1971) publicó los primeros resultados de electroforesis de proteínas en 1937, 2 pudo identificar la proteína albúmina (la proteína sérica más pequeña y abundante) por la banda afilada que produjo en el gel. Las otras proteínas séricas no pudieron resolverse en una simple electroforesis proteica, por lo que nombró a las tres bandas anchas, con muchas proteínas en cada banda, alfa, beta y gamma globulinas. Dos años después, el inmunólogo estadounidense Elvin Kabat (1914—2000) viajó a Suecia para trabajar con Tiselius utilizando esta nueva técnica y demostró que los anticuerpos migraban como gammaglobulinas. 3 Con este nuevo entendimiento en la mano, los investigadores pronto aprendieron que el mieloma múltiple, por tratarse de un cáncer de células secretoras de anticuerpos, podría diagnosticarse tentativamente por la presencia de un gran pico M en la región de la gamma-globulina mediante electroforesis proteica. Previo a este descubrimiento, los estudios sobre la estructura de las inmunoglobulinas habían sido mínimos, debido a la dificultad de obtener muestras puras para estudiar. Los sueros de pacientes con mieloma múltiple demostraron ser una excelente fuente de inmunoglobulina monoclonal altamente enriquecida, proporcionando la materia prima para estudios durante los próximos 20 años más que resultaron en la elucidación de la estructura de la inmunoglobulina.
Ejercicio\(\PageIndex{4}\)
En general, ¿qué logra un ensayo de inmunoelectroforesis?
Ensayo de inmunotransferencia:La Western Blot
Después de realizar electroforesis en gel de proteínas, se pueden identificar proteínas específicas en el gel usando anticuerpos. Esta técnica se conoce como la Western blot. Después de la separación de proteínas por PAGE, los antígenos proteicos en el gel se transfieren e inmovilizan sobre una membrana de nitrocelulosa. Esta membrana puede entonces exponerse a un anticuerpo primario producido para unirse específicamente a la proteína de interés. Un segundo anticuerpo equipado con una baliza molecular se unirá entonces al primero. Estos anticuerpos secundarios se acoplan a otra molécula como una enzima o un fluoróforo (una molécula que fluoresce cuando se excita por la luz). Cuando se usan anticuerpos acoplados a enzimas, se agrega un sustrato cromogénico para la enzima. Este sustrato suele ser incoloro pero desarrollará color en presencia del anticuerpo. La fluorescencia o coloración del sustrato identifica la ubicación de la proteína específica en la membrana a la que se unen los anticuerpos (Figura\(\PageIndex{9}\)).
Típicamente, los anticuerpos policlonales se utilizan para los ensayos de transferencia Western. Son más sensibles que los mAbs debido a su capacidad para unirse a diversos epítopos del antígeno primario, y la señal de los anticuerpos policlonales es típicamente más fuerte que la de los mAbs. También se pueden usar anticuerpos monoclonales; sin embargo, son mucho más caros de producir y son menos sensibles, ya que solo son capaces de reconocer un epítopo específico.
Varias variaciones de la transferencia western son útiles en la investigación. En una transferencia suroccidental, las proteínas se separan por SDS-PAGE, se transfieren a una membrana de nitrocelulosa, se les permite renaturizar y luego se sondean con una sonda de ADN marcada de manera fluorescentemente o radiactiva; el propósito del suroeste es identificar interacciones específicas ADN-proteína. Las manchas de Far-Western se llevan a cabo para determinar las interacciones proteína-proteína entre proteínas inmovilizadas (separadas por SDS-PAGE, transferidas a una membrana de nitrocelulosa y dejadas renaturizar) y sondas de proteínas que no son anticuerpos. Las proteínas unidas que no son anticuerpos que interactúan con las proteínas inmovilizadas en una transferencia de lejano oeste pueden detectarse mediante radiomarcaje, fluorescencia o el uso de un anticuerpo con una baliza molecular enzimática.
Ejercicio\(\PageIndex{5}\)
¿Cuál es la función de la enzima en el ensayo de inmunotransferencia?
Inmunoensayo mediado por complemento
Una de las funciones clave de los anticuerpos es la activación (fijación) del complemento. Cuando el anticuerpo se une a bacterias, por ejemplo, ciertas proteínas del complemento reconocen el anticuerpo unido y activan la cascada del complemento. En respuesta, otras proteínas del complemento se unen a la bacteria donde algunas sirven como opsoninas para aumentar la eficiencia de la fagocitosis y otras crean agujeros en las membranas celulares bacterianas gramnegativas, causando lisis. Esta actividad lítica puede ser utilizada para detectar la presencia de anticuerpos contra antígenos específicos en el suero.
Los glóbulos rojos son buenos indicadores para usar al evaluar la citólisis mediada por complemento. La hemólisis de los glóbulos rojos libera hemoglobina, que es un pigmento de colores brillantes, y la hemólisis de incluso un pequeño número de glóbulos rojos hará que la solución se vuelva notablemente rosada (Figura\(\PageIndex{10}\)). Esta característica juega un papel en la prueba de fijación del complemento, que permite la detección de anticuerpos contra patógenos específicos. La prueba de fijación del complemento puede usarse para verificar si hay anticuerpos contra patógenos que son difíciles de cultivar en el laboratorio como hongos, virus o la bacteria Chlamydia.
Para realizar la prueba de fijación del complemento, se agrega antígeno de un patógeno al suero del paciente. Si hay anticuerpos contra el antígeno, el anticuerpo se unirá al antígeno y fijará todo el complemento disponible. Cuando posteriormente se agregan glóbulos rojos y anticuerpos contra glóbulos rojos a la mezcla, no quedará complemento para lisar los glóbulos rojos. Así, si la solución permanece clara, la prueba es positiva. Si no hay anticuerpos antipatógenos en el suero del paciente, los anticuerpos agregados activarán el complemento para lisar los glóbulos rojos, produciendo una prueba negativa (Figura\(\PageIndex{10}\)).
Vea este video para ver un esquema de los pasos de la prueba de fijación del complemento.
Ejercicio\(\PageIndex{6}\)
En una prueba de fijación del complemento, si el suero se vuelve rosado, ¿el paciente tiene anticuerpos contra el antígeno o no? Explique.
La tabla\(\PageIndex{1}\) resume los diversos tipos de ensayos anticuerpo-antígeno discutidos en esta sección.
| Tipo de ensayo | Mecanismo | Ejemplos |
|---|---|---|
| Precipitaciones | El anticuerpo se une al antígeno soluble, formando una precipitina visible | Prueba de anillo de precipitina para visualizar la formación de celosía en solución |
| Inmunoelectroforesis para examinar la distribución de antígenos tras electroforesis | ||
| Ensayo de Ouchterlony para comparar diversos antígenos | ||
| Ensayo de inmunodifusión radial para cuantificar antígenos | ||
| Floculación | El anticuerpo se une a moléculas insolubles en suspensión, formando agregados visibles | Prueba VDRL para sífilis |
| Neutralización | El anticuerpo se une al virus, bloqueando la entrada viral en las células diana y previniendo la formación de placas | Ensayo de reducción de placas para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes en sueros de pacientes |
| Activación del complemento | El anticuerpo se une al antígeno, induciendo la activación del complemento y sin dejar complemento para lisar los glóbulos rojos | Prueba de fijación del complemento para anticuerpos de pacientes contra bacterias difíciles de cultivar como la clamidia |
Conceptos clave y resumen
- Cuando están presentes en la proporción correcta, el anticuerpo y el antígeno formarán una precipitina, o retículo que precipita de la solución.
- Se puede usar una prueba de anillo de precipitina para visualizar la formación de celosía en solución. El ensayo de Ouchterlony demuestra la formación de celosía en un gel. El ensayo de inmunodifusión radial se utiliza para cuantificar el antígeno midiendo el tamaño de una zona de precipitación en un gel infundido con anticuerpos.
- Los antígenos insolubles en suspensión formarán floculantes cuando se unan por anticuerpos. Esta es la base de la prueba VDRL para sífilis en la que los anticuerpos antitreponémicos se unen a cardiolipina en suspensión.
- Las infecciones virales se pueden detectar cuantificando anticuerpos neutralizantes de virus en el suero de un paciente.
- Se identifican diferentes clases de anticuerpos en plasma o suero mediante el uso de inmunoelectroforesis.
- La presencia de antígenos específicos (por ejemplo, proteínas bacterianas o virales) en el suero se puede demostrar mediante ensayos de transferencia Western, en los que las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y se identifican usando anticuerpos marcados.
- En la prueba de fijación del complemento, el complemento se utiliza para detectar anticuerpos contra diversos patógenos.
Notas al pie
- 1 Ouchterlony, Örjan, “Método in vitro para probar la capacidad productora de toxinas de bacterias diftéricas”, Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica 26, núm. 4 (1949): 516-24.
- 2 Tiselius, Arne, “Electroforesis de globulina sérica: análisis electroforético de sueros normales e inmunes”, Biochemical Journal 31, núm. 9 (1937): 1464.
- 3 Tiselio, Arne y Elvin A. Kabat. “Un estudio electroforético de sueros inmunes y preparaciones de anticuerpos purificados”, The Journal of Experimental Medicine 69, núm. 1 (1939): 119-31.