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1.8: Regla Coliforme Total

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Objetivos de aprendizaje

• Explicar las biopelículas
• Explicar las técnicas microbiológicas comunes
• Esquema y descripción del análisis bacteriano coliforme

Técnicas microbiológicas comunes

Biofilms

Una biopelícula comienza a formarse cuando las bacterias que nadan libremente, planctónicas, se adhieren a una superficie. Si las bacterias crecieran en una monocapa de espesor uniforme, se harían superpobladas, los nutrientes no estarían disponibles en profundidades más bajas y se acumularían desechos tóxicos. Los microorganismos en las comunidades de biopelículas evitan estos problemas al formar estructuras tipo pilar con canales entre ellas, para que el agua pueda transportar los nutrientes entrantes a las células y llevar los desechos salientes lejos de las células. Esto constituye un sistema circulatorio primitivo. Los microbios individuales y los grupos de limo ocasionalmente abandonan la biopelícula establecida y se trasladan a una nueva ubicación donde la biopelícula se extiende. Dicha biopelícula generalmente está compuesta por una capa superficial de aproximadamente 10 micrones de espesor, con pilares que se extienden 200 micrones por encima de la superficie.

Los microorganismos en las biopelículas pueden trabajar cooperativamente para llevar a cabo tareas complejas. Las biopelículas son elementos esenciales en los sistemas de tratamiento de aguas residuales, y pueden ser un problema en tuberías y tuberías donde sus acumulaciones impiden el flujo de agua.

Medios de cultivo

Un material nutritivo preparado para el crecimiento de microorganismos en un laboratorio se denomina medio de cultivo. Algunas bacterias pueden crecer bien en cualquier medio de cultivo, y otras bacterias requieren medios especiales. Otras bacterias no pueden crecer en ningún medio no vivo. Los microbios que se introducen en un medio de cultivo para iniciar el crecimiento se denominan inóculo. Los microbios que crecen y se multiplican en o sobre un medio de cultivo se denominan cultivo.

Una amplia variedad de medios están disponibles para el crecimiento de microorganismos en el laboratorio. Estos medios tienen componentes premezclados y solo requieren la adición de agua y luego esterilización. Los medios se desarrollan o revisan constantemente para su uso en el aislamiento e identificación de bacterias que son de interés para investigadores en campos como alimentos, agua y microbiología clínica.

Cuando es deseable cultivar bacterias en un medio sólido, se agrega al medio un agente solidificante como agar. Un polisacárido complejo derivado de una alga marina, el agar se ha utilizado durante mucho tiempo como espesante en alimentos como jaleas y helados.

Agar medial están contenidos en tubos de ensayo o cajas de Petri. Los tubos de ensayo se denominan inclinados cuando se permite que su contenido se solidifique dentro del tubo que se mantiene en ángulo para que se disponga de una gran superficie para el crecimiento. Cuando el agar se solidifica en un tubo vertical, se le llama profundo. Las placas Petri son platos poco profundos con una tapa que anida sobre el fondo para evitar la contaminación. Cuando la placa está llena, se llama placas de Petri.

Medio Definido Químicamente

Para apoyar el crecimiento microbiano, los medios proporcionan fuentes de energía, así como fuentes de carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y cualquier factor de crecimiento orgánico que el organismo sea incapaz de sintetizar. Un medio químicamente definido es donde se conoce la composición química exacta de los medios. Para un microorganismo quimioheterótrofo, el medio químicamente definido contiene factores de crecimiento orgánicos que sirven como fuente de carbono y energía. Por ejemplo, la glucosa se incluye en los medios para cultivar la E. coli quimioheterótrofa.

Los organismos que requieren muchos factores de crecimiento se describen como fastidiosos. Organismos de este tipo como Lactobacillus a veces se utilizan en pruebas que determinan la concentración de una vitamina particular en una sustancia. Para realizar un ensayo microbiológico, se prepara un medio de crecimiento que contiene todos los requisitos de crecimiento de la bacteria excepto la vitamina que se está ensayando. Luego se combinan el medio, la sustancia de prueba y las bacterias, y se mide el crecimiento de las bacterias. El crecimiento bacteriano, que se refleja en la cantidad de ácido láctico producido, será proporcional a la cantidad de la vitamina en la sustancia de prueba. Cuanto más ácido láctico, más células de Lactobacillus son capaces de crecer, así que más vitamina está presente.

Medios Complejos

El medio químicamente definido se suele reservar para actividades experimentales de laboratorio o para el crecimiento de bacterias autótrofas. La mayoría de las bacterias y hongos heterótrofos se cultivan en medios complejos compuestos por nutrientes, incluidos extractos de levaduras, carne o plantas, o digestiones de proteínas de estas fuentes. La composición química exacta varía ligeramente de lote a lote.

En medios complejos, los requerimientos de energía, carbono, nitrógeno y azufre de los microorganismos en crecimiento son proporcionados por proteínas. La proteína es una molécula grande e insoluble que una minoría de microorganismos puede utilizar directamente; sin embargo, la digestión parcial de las proteínas por ácidos o enzimas reduce la proteína a cadenas más cortas de aminoácidos llamadas peptonas. Estos pequeños fragmentos solubles pueden ser digeridos por bacterias.

Las vitaminas y otros factores de crecimiento orgánicos son proporcionados por extractos de carne o extractos de levadura. Las vitaminas y minerales solubles de las carnes o levaduras se disuelven en el agua de extracción la cual se evapora para que los factores se concentren. Si un medio complejo está en forma líquida, se llama caldo nutritivo. Cuando se agrega agar, se llama agar nutritivo.

Medios y métodos de crecimiento anaeróbico

El cultivo de bacterias anaerobias plantea un problema especial. Debido a que los anaerobios pueden ser destruidos por la exposición al oxígeno, se deben usar medios especiales llamados medios reductores. Estos medios contienen ingredientes, como el tioglicolato de sodio, que se combinan químicamente con el oxígeno disuelto y agotan el oxígeno en el medio de cultivo. Para cultivar y mantener de manera rutinaria cultivos puros de anaerobios obligados, los microbiólogos utilizan medios reductores almacenados en tubos de ensayo ordinarios y herméticamente tapados. Estos medios se calientan poco antes de su uso para eliminar el oxígeno absorbido.

Cuando los cultivos deben cultivarse en placas Petri para observar colonias individuales, los laboratorios utilizan sistemas que incuban microorganismos en cajas y frascos sellados en los que se elimina químicamente el oxígeno después de que se hayan introducido las placas de cultivo y se selle el recipiente.

Técnicas Especiales de Cultura

Muchas bacterias no se han cultivado con éxito en medios de laboratorio artificiales. Mycobacterium leprae, el bacilo de la lepra, se cultiva en armadillos, los cuales tienen una temperatura corporal relativamente baja que coincide con los requerimientos del microbio. Con pocas excepciones, las bacterias intracelulares obligadas, como la rickettsia y la clamidia, no crecen en medios artificiales. Los virus solo pueden reproducirse en una célula hospedadora viva, también. Se emplean técnicas especiales para aislar este tipo de organismos.

Medio Selectivo y Diferencial

Frecuentemente es necesario detectar la presencia de microorganismos específicos asociados a enfermedades o mal saneamiento. Para esta tarea se utilizan medios selectivos y diferenciales. El medio selectivo está diseñado para suprimir el crecimiento de bacterias no deseadas y fomentar el crecimiento del microbio deseado. El agar sulfito de bismuto es un medio utilizado para aislar la bacteria tifoidea, Gram negativa Salmonella typhus, de las heces. El sulfito de bismuto inhibe las bacterias gram positivas y la mayoría de las bacterias intestinales gram negativas El agar dextrosa de Sabouraud, tiene un pH de 5.6 y se utiliza para aislar hongos que superan a las bacterias a este pH.

El medio diferencial facilita la distinción de colonias del organismo deseado de otras colonias que crecen en la misma placa. Los cultivos puros de microorganismos tienen reacciones identificables con medios diferenciales en tubos o en placas. El agar de sangre se utiliza para identificar especies bacterianas que destruyen los glóbulos rojos. Estas especies como las progenies de estreptococos muestran un anillo claro alrededor de sus colonias donde han lisado las células sanguíneas circundantes.

Las características selectivas y diferenciales se combinan en un solo medio. Al aislar la bacteria Staphylococcus aureus se sabe que este organismo tiene tolerancia al cloruro de sodio y que fermenta carbohidrato manitol para formar ácido. Un agar de sal de manitol contiene 7.5% de cloruro de sodio, lo que desalienta el crecimiento de organismos competidores y el medio selecciona para S. aureus. El medio también contiene un indicador de pH que cambia de color si el manitol en el medio se fermenta a ácido. Las colonias fermentadoras de manitol de S. aureus se diferencian de las colonias de bacterias que no fermentan manitol. Las bacterias que crecen a concentraciones de sal y fermentan manitol a ácido se identifican por el cambio de color, y son las colonias de S. aureus. El uso de medios diferenciales también puede ser utilizado para identificar E. coli productoras de toxina.

Cultivo de enriquecimiento

Las bacterias en pequeñas cantidades se pueden pasar por alto, especialmente si otras bacterias están presentes en mayor número. Por ello, es necesario utilizar un cultivo de enriquecimiento. Esta técnica se utiliza especialmente para muestras de suelo y fecales. El medio para un cultivo de enriquecimiento es líquido y proporciona nutrientes y condiciones ambientales que favorecen el crecimiento de un microbio en particular y no de otros microbios. Se trata de un medio selectivo en este sentido. Está diseñado para aumentar pequeños números del tipo de organismo deseado a niveles detectables. La técnica incluye colocar la muestra en un medio de enriquecimiento líquido que favorezca a las especies que se desea aislar. El medio de cultivo se deja incubar por unos días, y después una pequeña cantidad del mismo se transfiere a otro matraz del mismo medio. Después de una serie de transferencias, la población sobreviviente consistirá en las bacterias que sean capaces de metabolizar los ingredientes en el medio. A las bacterias se les da tiempo para crecer en el medio entre transferencias. Este proceso es la etapa de enriquecimiento. Cualquier microbios en el inóculo original se diluye rápidamente con las transferencias sucesivas. Cuando la última dilución es rayada sobre el medio sólido de la misma composición, solo las colonias de los organismos deseados son capaces de usar los ingredientes especiales para crecer.

Culturas Puras

La mayoría de las muestras incluyen varios tipos diferentes de bacterias. Si estas muestras son sembradas sobre la superficie de un medio sólido, se formarán colonias que son copias exactas del organismo original. Una colonia visible teóricamente se deriva de una sola espora o célula vegetativa o de un grupo de los mismos microorganismos unidos entre sí en grupos o cadenas. Las colonias microbianas suelen tener una apariencia distintiva que distingue a un microbio de otra especie. Las bacterias deben distribuirse lo suficientemente ampliamente en la placa para que las colonias estén visiblemente separadas de otras especies microbianas.

La mayoría de las investigaciones de microbios requieren un cultivo puro, o clones de bacterias. El método de aislamiento utilizado para lograr cultivos puros es el método de placa de rayas. Un asa de inoculación estéril se sumerge en un cultivo mixto que contiene más de un tipo de microbio, y se raya en un patrón sobre la superficie del medio nutritivo. A medida que se traza el patrón, las bacterias se frotan del asa sobre el medio. Las últimas células que se frotaron del asa están lo suficientemente separadas como para crecer en colonias aisladas. Estas colonias pueden recogerse con un asa de inoculación y transferirse a un tubo de ensayo para medio nutritivo para formar un cultivo puro que contenga solo un tipo de bacteria.

Los métodos de placa de rayas funcionan bien cuando el organismo a aislar se presenta en un gran número en relación con la población total. Cuando el microbio a aislar está presente en pequeñas cantidades, su número debe aumentarse mediante enriquecimiento selectivo antes de que pueda aislarse con el método de la placa de rayas.

Análisis bacteriano coliforme

El vertido de desechos de las alcantarillas municipales es uno de los temas de calidad del agua más importantes. Es de particular importancia para las fuentes de agua potable. Las aguas residuales municipales contienen heces humanas y el agua contaminada con estos efluentes puede contener organismos patógenos (causantes de enfermedades) y, en consecuencia, puede ser peligrosa para la salud humana si se usa como agua potable o en la preparación de alimentos. La contaminación fecal del agua se detecta rutinariamente mediante análisis microbiológicos.

No es práctico intentar el aislamiento rutinario de patógenos porque están presentes en números relativamente pequeños en comparación con otros tipos de microorganismos. Además, existen muchos tipos de patógenos, y cada organismo requiere una técnica única de aislamiento microbiológico. El enfoque que se ha adoptado es analizar muestras para organismos indicadores que habitan el intestino y se excretan en heces humanas. La presencia de estos organismos indicadores en el agua es evidencia de que la contaminación fecal está presente, y existe el riesgo de que los patógenos estén presentes.

Si los organismos indicadores están presentes en grandes cantidades, la contaminación se considera reciente y/o grave. Las bacterias en el agua, en general, no están presentes individualmente, sino como grumos o en asociación con materia particulada. Al enumerar bacterias en el agua, no es el número de bacterias individuales presentes lo que se cuenta, sino el número de grupos de bacterias o las partículas y sus bacterias asociadas. Cada grupo o partícula puede tener muchas bacterias asociadas con él.

Coliformes Totales

El término coliformes totales se refiere a un gran grupo de bacterias Gram-negativas en forma de varilla que comparten varias características. El grupo incluye coliformes termos tolerantes y bacterias de origen fecal, así como algunas bacterias que pueden aislarse de fuentes ambientales. La presencia de coliformes totales puede o no indicar contaminación fecal. En casos extremos, un recuento alto para el grupo coliforme total puede estar asociado con un recuento bajo, o cero, para coliformes termos tolerantes. Un resultado de esta naturaleza no necesariamente indicaría la presencia de contaminación fecal. Podría ser causada por la entrada de suelo o materia orgánica al agua o por condiciones adecuadas para el crecimiento de otros tipos de coliformes. En el laboratorio los coliformes totales se cultivan en o sobre un medio que contiene lactosa, a una temperatura de 35 o 37 °C, se identifican provisionalmente por la producción de ácido y gas a partir de la fermentación de lactosa.

El término coliforme fecal se ha utilizado en microbiología del agua para denotar organismos coliformes que crecen a 44 o 44.5 C y fermentan lactosa para producir ácido y gas. En la práctica, algunos organismos con estas características pueden no ser de origen fecal y el término coliforme termoltolerante es, por lo tanto, más correcto y cada vez se usa más comúnmente. Sin embargo, la presencia de coliformes termos tolerantes casi siempre indica contaminación fecal.

Por lo general, más del 95 por ciento de los coliformes termos tolerantes aislados del agua son el organismo intestinal Escherichia coli, cuya presencia es prueba definitiva de contaminación fecal. Como resultado, a menudo es innecesario realizar más pruebas para confirmar la presencia específica de E. coli.

La presencia de estreptococos fecales es evidencia de contaminación fecal. Los estreptococos fecales tienden a persistir más tiempo en el ambiente que los coliformes termos tolerantes o totales y son altamente resistentes al secado. Por lo tanto, es posible aislar estreptococos fecales del agua que contiene pocos o ningún coliformes termo tolerantes como, por ejemplo, cuando la fuente de contaminación está distante en el tiempo o el espacio del punto de muestreo. Los estreptococos fecales crecen en o sobre un medio que contiene azida sódica, a una temperatura de 37-44 °C, generalmente se detectan por la reducción de un colorante (un compuesto que contiene tetrazolio) o la hidrólisis de la esculina. Los métodos rutinarios pueden dar falsos positivos y pueden requerirse pruebas confirmatorias adicionales.

Recuento de Placas Heterotróficas

El recuento de placas heterótrofas incluye todos los microorganismos que son capaces de crecer en o sobre un medio de agar sólido rico en nutrientes. Se utilizan dos temperaturas y tiempos de incubación. Son 37 °C durante 24 horas para fomentar el crecimiento de bacterias de origen mamífero, y 22 °C durante 72 horas para enumerar bacterias que se derivan principalmente de fuentes ambientales. El valor primario de los recuentos de colonias radica en comparar los resultados de muestras repetidas de la misma fuente. Si los niveles aumentan sustancialmente con respecto a los valores normales, puede existir un motivo de preocupación.

Selección de una Técnica Analítica Bacteriológica

Se utilizan comúnmente dos técnicas para detectar la presencia de coliformes en el agua. La primera técnica se llama el tubo de fermentación múltiple o técnica de número más probable. En este método se colocan porciones medidas de una muestra de agua en tubos de ensayo que contienen un medio de cultivo. Luego, los tubos se incuban durante un tiempo estándar a una temperatura estándar. En la segunda técnica, se pasa un volumen medido de muestra a través de un filtro fino que retiene bacterias. Luego se coloca el filtro en medio de cultivo y se incuba. A esto se le llama la técnica de filtro de membrana.

Técnica de tubo de fermentación múltiple

La técnica se ha utilizado para el análisis del agua potable desde hace muchos años con resultados satisfactorios. Es el único procedimiento que se puede utilizar si las muestras de agua son muy turbias o si se van a analizar semisólidos como sedimentos o lodos. El procedimiento seguido es fundamental para los análisis bacteriológicos y la prueba se utiliza en muchos países. Se acostumbra reportar los resultados de la prueba de múltiples tubos de fermentación para coliformes como índice de número más probable (MPN). Este es un índice del número de bacterias coliformes que, más probablemente que cualquier otro número, darían los resultados mostrados por la prueba. No es un recuento del número real de bacterias indicadoras presentes en la muestra.

Cada parte de la prueba requiere de un tipo diferente de medio. Por ejemplo, al enumerar coliformes, se usa caldo de lauril triptosa (lactosa) en la primera parte (de aislamiento o presuntiva) de la prueba. En la segunda parte (confirmación), se utiliza caldo de bilis de lactosa verde brillante (BGLB) para confirmar coliformes totales y medio de E. coli para confirmar coliformes fecales.

Técnica de filtro de membrana

La técnica de filtro de membrana se puede utilizar para probar un número relativamente grande de muestras y produce resultados más rápidamente que la técnica de múltiples tubos de fermentación. Originalmente fue diseñado para su uso en el laboratorio pero ahora se dispone de equipo portátil que permite el uso de la técnica en el campo.

El método de filtro de membrana da un recuento directo de coliformes totales y coliformes fecales presentes en una muestra dada de agua. Un volumen medido de agua se filtra, bajo vacío, a través de una membrana de acetato de celulosa de diámetro de poro uniforme, generalmente 0.45 µm. Las bacterias se retienen en la superficie de la membrana la cual se coloca en un medio selectivo adecuado en un recipiente estéril y se incuba a una temperatura apropiada. Si los coliformes y/o coliformes fecales están presentes en la muestra de agua, se forman colonias características que se pueden contar directamente.

La técnica es inadecuada para aguas naturales que contienen niveles muy altos de material suspendido, lodos y sedimentos. Cada circunstancia podría bloquear el filtro antes de que pase un volumen adecuado de agua. Cuando se van a analizar pequeñas cantidades de una muestra (efluente de aguas residuales o agua superficial muy contaminada), es necesario diluir una porción de la muestra en un diluyente estéril para asegurar que un volumen suficiente para filtrar esté presente en toda la superficie de la membrana.

Si existe duda sobre la probable densidad bacteriana, es recomendable probar dos o más volúmenes para asegurar que el número de colonias en la membrana esté en el rango óptimo para el conteo (20-80 colonias por membrana). Si no se puede filtrar un volumen adecuado de muestra a través de una sola membrana, la muestra puede filtrarse a través de dos o más membranas y agregar el número de colonias en las membranas para dar el recuento total de la muestra.

Las técnicas de filtración por membrana y recuento de colonias suponen que cada bacteria, grupo de bacterias o partícula con bacterias adheridas, dará lugar a una sola colonia visible. Cada grupo o partícula es, por lo tanto, una unidad formadora de colonias (ufc), y los resultados se expresan como unidades formadoras de colonias por unidad de volumen. En el caso de bacterias coliformes termo tolerantes, el resultado debe reportarse como coliformes termo tolerantes [No.] cfu por 100 ml.

Preguntas de revisión

1. Describir una biopelícula.
2. Bacteriológicamente, ¿a qué se refiere el término coliformes?
3. Describir la Técnica de Tubo de Fermentación Múltiple para el cultivo de bacterias coliformes.
4. Describir un medio químicamente definido.

Cuestionario de capítulo

1. Un material nutritivo preparado para el crecimiento de microorganismos en un laboratorio se denomina (n) ___________.
1. Medio de enriquecimiento
2. Medio de cultivo
3. Medios selectivos
4. Medios complejos
2. ___________ está diseñado para suprimir el crecimiento de bacterias no deseadas y fomentar el crecimiento del microbio deseado.
1. Medio de enriquecimiento
2. Medio de cultivo
3. Medios selectivos
4. Medios complejos
3. Las bacterias en pequeñas cantidades se pueden pasar por alto, especialmente si otras bacterias están presentes en mayor número. Por ello, es necesario utilizar un (n) ___________.
1. Medio de enriquecimiento
2. Medio de cultivo
3. Medios selectivos
4. Medios complejos
4. La mayoría de las investigaciones de microbios requieren un cultivo puro, o clones de bacterias. El método de aislamiento utilizado para lograr cultivos puros es el ___________.
1. Selección selectiva
2. Método de placa de rayas
3. Método de inoculación
4. Método de medio definido
5. El término ___________ se refiere (s) a un gran grupo de bacterias Gram-negativas en forma de varilla que comparten varias características. El grupo incluye bacterias termo tolerantes de origen fecal.
1. Virus
2. Protozoarios
3. Parásito
4. Coliformes totales
6. Esta técnica para identificar coliformes es el único procedimiento que se puede utilizar si las muestras de agua son muy turbias o si se van a analizar semisólidos como sedimentos o lodos. El procedimiento seguido es fundamental para los análisis bacteriológicos y la prueba se utiliza en muchos países. Se acostumbra reportar los resultados como índice de número más probable (MPN).
1. Técnica de tubo de fermentación múltiple
2. Técnica de filtro de membrana
3. Recuento de Placas Heterotróficas
4. Sabouraud
7. ___________ asumir que cada bacteria, grupo de bacterias, o partícula con bacterias adheridas, dará lugar a una sola colonia visible. Cada grupo o partícula es, por lo tanto, una unidad formadora de colonias (ufc), y los resultados se expresan como unidades formadoras de colonias por unidad de volumen. En el caso de bacterias coliformes termo tolerantes, el resultado debe reportarse como coliformes termo tolerantes [No.] cfu por 100 ml.
1. Técnica de tubo de fermentación múltiple
2. Técnica de filtro de membrana
3. Recuento de Placas Heterotróficas
4. Sabouraud
8. El sulfito de bismuto inhibe las bacterias gram positivas y la mayoría de las bacterias intestinales gram negativas. El agar ___________ tiene un pH de 5.6 y se usa para aislar hongos que superan a las bacterias.
1. Técnica de tubo de fermentación múltiple
2. Técnica de filtro de membrana
3. Recuento de Placas Heterotróficas
4. Sabouraud
9. El conteo ___________ incluye microorganismos que son capaces de crecer en o sobre un medio de agar sólido rico en nutrientes. Se utilizan dos temperaturas y tiempos de incubación. Son 37 °C durante 24 horas para fomentar el crecimiento de bacterias de origen mamífero, y 22 °C durante 72 horas para enumerar bacterias que se derivan principalmente de fuentes ambientales.
1. Técnica de tubo de fermentación múltiple
2. Técnica de filtro de membrana
3. Recuento de Placas Heterotróficas
4. Sabouraud
10. Más del 95 por ciento de los coliformes termos tolerantes aislados del agua son el organismo intestinal, ___________, cuya presencia es prueba definitiva de contaminación fecal.
1. Streptococcus
2. E. coli
3. Staphylococcus
4. Bacteroides

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