3.6: Cinética enzimática (actividad)
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La enzima
La amilasa es una enzima que descompone la amilosa (almidón) en moléculas de glucosa.
- ¿Qué prueba se puede utilizar para indicar la presencia de Almidón?
- ¿Qué parámetros influirían en la capacidad de la enzima para facilitar la velocidad de reacción?
- ¿Cuál es el papel de una enzima en una reacción química y de qué está hecha?
- ¿Qué prueba se puede utilizar para indicar la presencia de glucosa?
La amilasa salival se produce en la boca, donde comienza la digestión.
La amilasa pancreática se produce en el páncreas y se suministra al duodeno del intestino delgado.
Sobreposición de moléculas de amilasa salival (verde) y pancreática (verde azulado).
Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
- Agrega 5 ml de H 2 O a un tubo (este es el BLANCO).
- Añadir 5 ml de almidón (sustrato) a 3 tubos separados.
- Uno en hielo (0°C), uno en el banco (25°C) y uno en un baño de agua a 40°C
- Agrega 2 gotas de yodo a cada tubo y mezcla: Blanco, 0°C, 25°C y 40°C.
- Lea el Blank en el espectrofotómetro y calibra al 100% de transmitancia a 560nm.
- Lee cada tubo en el espectrofotómetro. Este es el tiempo 0 minuto.
- Agrega 35 gotas de solución de amilasa a cada tubo simultáneamente. Mezclar y asegurar que la incubación se produzca a la temperatura correcta.
- A intervalos de 2 minutos, lea rápidamente TODOS los tubos en el espectrofotómetro e inmediatamente devuelva los tubos a la temperatura adecuada.
- Continuar leyendo las muestras cada 2 minutos hasta llegar a los 22 minutos en la siguiente tabla.
-
Tiempo (min)
0ºC
% Trans
25ºC
% Trans
40ºC
% Trans
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Efecto del pH sobre la actividad enzimática
- Añadir 5 ml de agua a un tubo vacío (este es el BLANCO)
- A 3 tubos separados, agregue 2.5 ml de tampón pH 3, pH 5 o pH 7
- Añadir 2.5 ml de almidón (sustrato) a cada uno de estos tubos (excluyendo el BLANCO)
- Agrega 2 gotas de yodo a cada tubo y mezcla: Blanco, pH 3, pH 5, pH 7
- Lea el Blank en el espectrofotómetro y calibrarlo al 100% de transmitancia a 560 nm
- Lee cada tubo en el espectrofotómetro. Este es el tiempo 0 min.
- Agrega 35 gotas de solución de amilasa a cada tubo simultáneamente, mezcla hasta homogeneidad.
- A intervalos de 2 minutos, lea rápidamente TODOS los tubos en el espectrofotómetro.
- Continuar leyendo las muestras cada 2 minutos hasta llegar a los 22 minutos en la siguiente tabla.
|
Tiempo (min) |
pH 3 % Trans |
pH 5 % Trans |
pH 7 % Trans |
|
0 |
|||
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2 |
|||
|
4 |
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6 |
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8 |
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10 |
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12 |
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14 |
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16 |
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18 |
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20 |
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22 |
Efecto de la concentración enzimática sobre la actividad enzimática
- Añadir 5 ml de agua a un tubo vacío (este es el BLANCO)
- Agregar 5 ml de tampón pH 7 a 3 tubos separados.
- Siga el esquema de dilución a continuación:
Esquema de dilución para amilasa (enzima)
- En 4 tubos separados, AGREGAR 4 ml de solución de almidón.
- Etiquetarlos 1x, 1/5x, 1/25x, 1/125x
- Agrega 2 gotas de yodo a cada tubo de almidón y el Blank.
- Lea el Blank en el espectrofotómetro y calibra al 100% de transmitancia a 560nm.
- Lee cada tubo en el espectrofotómetro. Este es el tiempo 0 minuto.
- Agregue 35 gotas de soluciones diluidas de amilasa a los tubos debidamente etiquetados simultáneamente y mezcle.
- Cada tubo recibe una dilución de amilasa diferente.
- A intervalos de 2 minutos, lea rápidamente TODOS los tubos en el espectrofotómetro.
- Continuar leyendo las muestras cada 2 minutos hasta llegar a los 22 minutos en la siguiente tabla.
|
Tiempo (min) |
1 X % Trans |
1/5 X % Trans |
1/25 X % Trans |
1/125 X % Trans |
|
0 |
||||
|
2 |
||||
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4 |
||||
|
6 |
||||
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8 |
||||
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10 |
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12 |
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14 |
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16 |
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18 |
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20 |
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22 |
Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática
- Añadir 5 ml de agua a un tubo vacío (este es el BLANCO)
- Agregar 5 ml de tampón pH 7 a 3 tubos separados
- Siga el esquema de dilución a continuación:
- En 4 cubetas, AGREGAR 4 ml de la solución diluida de almidón.
- Etiquetarlos 1x, 1/2x, 1/4x, 1/8x.
- Agrega 2 gotas de yodo a cada tubo de almidón y el Blank.
- Lea el Blank en el espectrofotómetro y calibra al 100% de transmitancia a 560nm.
- Lee cada tubo en el espectrofotómetro. Este es el tiempo 0 minuto.
- Agrega 35 gotas de solución de amilasa a cada tubo simultáneamente y mezcla.
- A intervalos de 2 minutos, lea rápidamente TODOS los tubos en el espectrofotómetro.
- Continuar leyendo las muestras cada 2 minutos hasta llegar a los 22 minutos en la siguiente tabla.
|
Tiempo (min) |
1 X % Trans |
1/2 X % Trans |
1/4 X % Trans |
1/8 X % Trans |
|
0 |
||||
|
2 |
||||
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4 |
||||
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6 |
||||
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8 |
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10 |
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12 |
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14 |
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16 |
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18 |
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20 |
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22 |
Trazar los resultados
- Usando un plot.ly, grafica los datos en el mismo gráfico.
- Calcular la línea de mejor ajuste de cada conjunto de datos.
- La pendiente representa la actividad de la enzima en cada condición. ¿Cuál es la unidad de esta actividad?