8.6: Huellas de ADN (RFLP)

El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es una técnica que explota variaciones en las secuencias de ADN. El ADN de diferentes fuentes tendrá variaciones o polimorfismos a lo largo de la secuencia. Usando Enzimas de Restricción, estas diferencias en las secuencias pueden ser provocadas. Sin embargo, si se tomara la totalidad del genoma humano y se cortara con una enzima de restricción, se harían muchos fragmentos indescifrables. De hecho, el gel de agarosa resultante simplemente mostraría un gran frotis de ADN. El análisis RFLP requiere que se use una sonda a un área específica de ADN para identificar ubicaciones específicas. Los geles de agarosa se transferirían a una membrana o filtro donde se hibridarían con estas sondas radiactivas.

Cromosomas homólogos con sitios de restricción señalados por triángulos. El rectángulo que se asienta sobre los cromosomas corresponde a un locus sonda. Crédito: Jeremy Seto (CC0)

El análisis RFLP fue diseñado para que la ciencia forense discrimine entre personas. Dado que las personas son 2N, tienen pares de cromosomas homólogos con los mismos loci. Sin embargo, estos loci pueden contener diferentes alelos. En este caso, el fenotipo para estos alelos es la secuencia real que puede o no contener sitios de restricción. La presencia o ausencia de un sitio de restricción puede surgir de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que revelan la variación natural entre las personas.
El siguiente esquema ilustra una comparación de perfiles de restricción entre dos fuentes. Obsérvese que la sonda se solapa con un sitio de restricción en uno de los alelos. Esta sonda será capaz de unirse a ambos fragmentos dado suficiente solapamiento de secuencia. Al resolverse en un gel de agarosa, el ADN genómico que no se hibrida con la sonda oscurecerá el locus de interés como un frotis grande. Se coloca un filtro encima de la agarosa y se presiona contra ella para transferir el ADN en un proceso llamado Southern Brotting. Después de una larga transferencia, el filtro se desnaturaliza e incuba con la sonda radiactiva. Para visualizar esta hibridación de sonda, se expone una película al filtro y se procesa.

Después de la digestión de restricción, las muestras se resuelven en un gel de agarosa. La digestión del ADN genómico dará como resultado un frotis grande. Después de la transferencia del ADN a una membrana a través de la acción capilar, la membrana se sondea con ADN sonda radiactiva. La sonda se une selectivamente a secuencias complementarias para revelar una serie de bandas distintas. Demostración interactiva de las primeras huellas de ADN.

Crédito: Oder Zeichner: abigail [o CC-BY-SA-3.0] /Autorradiograma

La muestra A solo revela una banda después del procesamiento porque esta persona es homóloga para el mismo alelo. La muestra B es heterocigota y revela tres bandas.

Crédito: Retama (CC-BY-SA 4.0)

Los RFLP representan marcadores heredables y pueden revelar relaciones entre diferentes individuos. Un pedigrí puede ilustrar la relación de los alelos heredados. La técnica puede ser más informativa si se usan múltiples sondas simultáneamente para diferentes loci o para usar sondas multi-locus que hibridan con múltiples ubicaciones.

Las RFLP pueden surgir de diferencias en las repeticiones de STR/VNTR entre sitios de restricción. Crédito: Jeremy Seto (CC0)

Si bien las RFLP pueden surgir de los SNP, también pueden ser causadas por la expansión o contracción de elementos repetidos entre sitios de restricción. Estos elementos repetidos del ADN se denominan repeticiones en tándem de número variable (VNTR) e ilustran polimorfismos que normalmente ocurren en regiones no codificantes del genoma.

Páginas Relacionadas

• Enzimas de restricción
• Analizando ADN
• VNTR
• Genética

Recursos Externos

• Uso de repeticiones en tándem para huellas digitales de ADN (Entrevista)
• La primera huella digital de ADN (Flash Simulation)

Huellas de ADN (Actividad)

1. El origen de las muestras de ADN para este ejercicio será explicado por el Instructor ya que se pueden utilizar numerosos escenarios (Edvotek Cat. #109).
2. Preparar un gel de agarosa al 1% añadiendo 60ml de tampón Tris-borato-EDTA (TBE) a 0.6g de agarosa en un matraz Erlenmeyer.
3. Colocar el matraz en un microondas o en el calor hasta que se derrita la agarosa.
   • Deténgase periódicamente y arremoline la solución. No permita que se hierva.
4. Montar la bandeja de fundición bloqueando los extremos con cinta adhesiva o cestas de plástico.
5. Coloca el peine en la bandeja de colada en el extremo NEGATIVO.
6. El instructor agregará 6μl Sybr Safe a su propia solución de gel en este momento.
7. Puede colocar las bandejas de fundición dentro de un refrigerador y verter la solución en la bandeja.
8. Espere hasta que el gel se solidifique.
9. Separe cuidadosamente las juntas de la bandeja asegurando no desgarrar los pozos hechos por el peine.
10. Retire el peine y coloque la bandeja de colada en una cámara de electroforesis.
11. Cubra el gel con tampón TBE.
12. Usando un micropipeteador, cargue muestras de colorante de 40-50μl secuencialmente en los pozos.
13. Cubra la cámara de electroforesis con la tapa y asegure un buen contacto entre los electrodos.
    • Es convencional que el lado POSITIVO del tanque esté más cerca de ti.
    • Con el lado POSITIVO más cercano a usted, cargue las muestras de izquierda a derecha.
14. Ajuste la fuente de alimentación a 100-120V, presione el botón Ejecutar (debería ver burbujas en cada electrodo) y dejar funcionar durante al menos 40 minutos.
15. Después de 40 minutos, detenga la corriente y retire el gel en la bandeja de colada.
16. Deslice los geles en la solución de tinción si no incluyen Sybr Safe para la visualización del tiempo de reunión posterior.
17. El instructor deslizará el gel sobre un transiluminador UV detrás de un escudo y mostrará los resultados a la clase.
    • Documente los hallazgos del gel fotografiando con su teléfono.
    • El instructor discutirá los resultados y le pedirá que interprete los hallazgos.

Seguimiento de la actividad

1. ¿Por qué las muestras se cargan en el lado negativo del gel?

2. ¿Cuál es el papel del tinte en estas muestras? ¿Deberíamos alarmarnos que las muestras son todas del mismo color?

3. ¿Qué significa que hay múltiples bandas en un carril? ¿Qué significa que solo hay una banda en un carril?

4. ¿Qué podemos concluir de los patrones de bandas en este caso forense o paternidad? ¿Son estos datos suficientes para estas conclusiones?