11.3: Miniprep de ARN (Actividad)

Ejercicio: Miniprep de ARN

La purificación de ARN ocurre similar a las preparaciones de ADN. Se utiliza una columna a base de sílica donde se excluye el ADN de la unión en función del tamaño y a través de una etapa adicional de digestión del ADN usando la enzima DNasa I. El ARN es extremadamente frágil y propenso a la degradación. Debido a esto, generalmente se usan pipetas y plásticos separados en los laboratorios para reducir la cantidad de exposición a RNasa ambiental o experimental. Al manipular ARN, tenga mucho cuidado de contaminar los tampones o muestras. Siempre use guantes ya que la piel lleva enzimas RNasa. Abstenerse de hablar para no contaminar el área con RNasa que se encuentra en la saliva.

RLT = tampón de lisis de ARN: contiene guanidina, un desnaturalizante severo
RW1 = tampón de lavado de ARN
RPE = Segundo tampón de lavado de ARN con etanol
RDD = tampón de digestión de ADNasa

1. Cosechar un máximo de 1 x 10 ⁷ células, como un sedimento celular o por lisis directa en el recipiente. Agrega el volumen apropiado de Buffer RLT y vórtice vigorosamente.

• Si < 5 x 10 ⁶ celdas → 350 μl RLT (placa < 6cm)
• Si ≤ 1 x 10 ⁷ celdas → 600 μl RLT (placa de 6-10cm)

2. Agregar 1 volumen de etanol al 70% al lisado, y mezclar bien pipeteando. No centrifugar. Proceder inmediatamente al siguiente paso.
3. Transfiera hasta 700 μl de la muestra, incluyendo cualquier precipitado, a una columna giratoria colocada en un tubo de recolección de 2 ml (suministrado).
   1. Cierre la tapa y centrifugue por 15 s a ≥8000 x g.
   2. Deseche el flujo continuo.
4. Lavado: Agregue 350 μl de Buffer RW1 a la columna de centrifugación, cierre la tapa, centrifugue durante 15 s a ≥8000 x g (≥10,000 rpm). Deseche el flujo continuo.
5. Agregue 10 μl de solución madre de DNasa I (ver arriba) a 70 μl de Buffer RDD. Mezclar invirtiendo suavemente el tubo.
6. Eliminar el ADN (opcional): Agregue la mezcla de incubación de ADNasa I (70 μl) directamente a la membrana de la columna de centrifugación y colóquelo en la mesa (20—30°C) durante 15 minutos.
7. Lavado: Agregue 350 μl de Buffer RW1 a la columna de centrifugación, cierre la tapa, centrifugue durante 15 s a ≥8000 x g. Deseche el flujo continuo.
8. Agrega 700 μl Buffer RW1 a la columna de centrifugado. Cierre la tapa y centrifugue por 15 s a ≥8000 x g. Deseche el flujo pasante.
9. Agrega 500 μl Buffer RPE a la columna de centrifugado. Cierre la tapa y centrifugue por 15 s a ≥8000 x g. Deseche el flujo pasante.
10. Agrega 500 μl Buffer RPE a la columna de centrifugado. Cierre la tapa y centrifugue por 2 min a ≥8000 x g.
11. Deseche todo el flujo pasante y centrifugue a toda velocidad durante 1 min para secar la membrana.
12. Colocar la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recolección de 1.5 ml. Agregue 30 μl de agua libre de RNasa directamente a la membrana de la columna de centrifugación.
13. Cierre la tapa y centrifugue por 1 min a ≥8000 x g para eluir el ARN.
14. Agregue 30 μl de agua libre de RNasa directamente a la membrana de la columna de centrifugación. Cierre la tapa y centrifugue por 1 min a ≥8000 x g para eluir el ARN.

Transcripción inversa

El Dogma Central de Biología Molecular fue propuesto por Francis Crick, el co-descriptor de la estructura helicoidal bicatenaria del ADN. Este “dogma” fue un enunciado para describir el flujo de información genética para mostrar que el ADN alberga o almacena datos que se transcriben en ARN que posteriormente se traducen de nucleótidos a aminoácidos a través de la maquinaria de los ribosomas. Dado que el ADN es relativamente estático en su capacidad para almacenar información genética, la expresión de estos datos almacenados en el ARN intermedio o en el producto proteico final es de gran importancia. Imagina que el ADN en el núcleo de las células de tu mejilla es idéntico al ADN del núcleo de células en tu hígado. Si bien las instrucciones son idénticas, se trata de células claramente diferentes que tienen una diferencia en la expresión de proteínas. Imagínese un disco duro en una computadora que almacena información como 1's y 0's. Estos 1 y 0 no tienen significado hasta que programas específicos son llamados a actuar sobre esta información. De igual manera, se llama a diferentes programas para usar las instrucciones de tu ADN para hacer una célula de mejilla diferente a una célula hepática.

Crédito: Daniel Horspool (CC-BY-SA 3.0)

En 1970, Howard Temin y David Baltimore aislaron independientemente una enzima del Virus del Sarcoma de Rous y del Virus de la Leucemia Murina, respectivamente. Esta enzima fue capaz de violar el Dogma Central. Los genomas de estos virus consisten en ARN, no ADN. Durante el proceso de infección, esta enzima se encarga de convertir el ARN en ADN en un proceso llamado transcripción inversa. Esta enzima se llama lógicamente transcriptasa inversa (RT). Este descubrimiento fue recompensado con el Premio Nobel en 1975. Posteriormente, se descubrieron más virus que estaban compuestos por genomas de ARN que utilizaron este proceso, incluido el VIH. También se reconoció que otras enzimas dentro de las células tenían actividad transcriptasa inversa, como la telomerasa y los retrotransposones. En biología molecular, estas enzimas se utilizan para convertir el ARNm en copias complementarias de ADN llamadas ADNc. La suma total de todo lo que se transcribe en ARN se conoce como el transcriptoma. La síntesis de ADNc a partir de cualquier ARN transcrito se puede usar entonces para el análisis del transcriptoma.

Ejercicio: Transcripción inversa de ARNm eucariota

Los ARNm de eucariotas se modifican con colas poliadeniladas en 3′. Los cebadores oligo-dT se pueden usar para cebar el proceso de transcripción inversa de todos los ARNm. Todas las soluciones deben mantenerse en hielo.

1. Determinar la concentración de ARN total.
2. Ajustar la concentración de ARN a 0.1mg/ml usando agua libre de RNasa.
3. Combine 10 ml de ARN, 1 ml de oligo-dT (50μM) y 1 ml de mezcla de dNTP (10 mM cada uno).
4. Desnaturalizar la mezcla a 65°C por 5 minutos y luego colocar sobre hielo.
5. Combine lo siguiente en un tubo separado:
   1. 4μl Buffer 5X → contiene todas las sales y tampón de pH
   2. TDT 0,1 M de 2μl → un agente reductor para imitar el entorno celular
   3. 1μl RNaseout (40U/μL) → un inhibidor de ARNasa
   4. 1μl SuperScript III RT → la enzima transcriptasa inversa
6. Después de que la mezcla desnaturalizada haya sido suficientemente enfriada, agregue 8μl de mezcla enzimática.
7. Incubar 45°C por 1 hora.
8. Desactivar la enzima incubando 75°C durante 10 minutos.
9. Guarde su ADNc en el congelador.