2.5: Apéndice V- Preguntas y consejos comunes sobre gel de agarosa
- Page ID
- 57480
\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \)
\( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)
\( \newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)
( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\)
\( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\)
\( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\)
\( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\)
\( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)
\( \newcommand{\id}{\mathrm{id}}\)
\( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)
\( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\)
\( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\)
\( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\)
\( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\)
\( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\)
\( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\)
\( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\)
\( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)
\( \newcommand{\vectorA}[1]{\vec{#1}} % arrow\)
\( \newcommand{\vectorAt}[1]{\vec{\text{#1}}} % arrow\)
\( \newcommand{\vectorB}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \)
\( \newcommand{\vectorC}[1]{\textbf{#1}} \)
\( \newcommand{\vectorD}[1]{\overrightarrow{#1}} \)
\( \newcommand{\vectorDt}[1]{\overrightarrow{\text{#1}}} \)
\( \newcommand{\vectE}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash{\mathbf {#1}}}} \)
\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \)
\( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)
\(\newcommand{\avec}{\mathbf a}\) \(\newcommand{\bvec}{\mathbf b}\) \(\newcommand{\cvec}{\mathbf c}\) \(\newcommand{\dvec}{\mathbf d}\) \(\newcommand{\dtil}{\widetilde{\mathbf d}}\) \(\newcommand{\evec}{\mathbf e}\) \(\newcommand{\fvec}{\mathbf f}\) \(\newcommand{\nvec}{\mathbf n}\) \(\newcommand{\pvec}{\mathbf p}\) \(\newcommand{\qvec}{\mathbf q}\) \(\newcommand{\svec}{\mathbf s}\) \(\newcommand{\tvec}{\mathbf t}\) \(\newcommand{\uvec}{\mathbf u}\) \(\newcommand{\vvec}{\mathbf v}\) \(\newcommand{\wvec}{\mathbf w}\) \(\newcommand{\xvec}{\mathbf x}\) \(\newcommand{\yvec}{\mathbf y}\) \(\newcommand{\zvec}{\mathbf z}\) \(\newcommand{\rvec}{\mathbf r}\) \(\newcommand{\mvec}{\mathbf m}\) \(\newcommand{\zerovec}{\mathbf 0}\) \(\newcommand{\onevec}{\mathbf 1}\) \(\newcommand{\real}{\mathbb R}\) \(\newcommand{\twovec}[2]{\left[\begin{array}{r}#1 \\ #2 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\ctwovec}[2]{\left[\begin{array}{c}#1 \\ #2 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\threevec}[3]{\left[\begin{array}{r}#1 \\ #2 \\ #3 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\cthreevec}[3]{\left[\begin{array}{c}#1 \\ #2 \\ #3 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\fourvec}[4]{\left[\begin{array}{r}#1 \\ #2 \\ #3 \\ #4 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\cfourvec}[4]{\left[\begin{array}{c}#1 \\ #2 \\ #3 \\ #4 \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\fivevec}[5]{\left[\begin{array}{r}#1 \\ #2 \\ #3 \\ #4 \\ #5 \\ \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\cfivevec}[5]{\left[\begin{array}{c}#1 \\ #2 \\ #3 \\ #4 \\ #5 \\ \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\mattwo}[4]{\left[\begin{array}{rr}#1 \amp #2 \\ #3 \amp #4 \\ \end{array}\right]}\) \(\newcommand{\laspan}[1]{\text{Span}\{#1\}}\) \(\newcommand{\bcal}{\cal B}\) \(\newcommand{\ccal}{\cal C}\) \(\newcommand{\scal}{\cal S}\) \(\newcommand{\wcal}{\cal W}\) \(\newcommand{\ecal}{\cal E}\) \(\newcommand{\coords}[2]{\left\{#1\right\}_{#2}}\) \(\newcommand{\gray}[1]{\color{gray}{#1}}\) \(\newcommand{\lgray}[1]{\color{lightgray}{#1}}\) \(\newcommand{\rank}{\operatorname{rank}}\) \(\newcommand{\row}{\text{Row}}\) \(\newcommand{\col}{\text{Col}}\) \(\renewcommand{\row}{\text{Row}}\) \(\newcommand{\nul}{\text{Nul}}\) \(\newcommand{\var}{\text{Var}}\) \(\newcommand{\corr}{\text{corr}}\) \(\newcommand{\len}[1]{\left|#1\right|}\) \(\newcommand{\bbar}{\overline{\bvec}}\) \(\newcommand{\bhat}{\widehat{\bvec}}\) \(\newcommand{\bperp}{\bvec^\perp}\) \(\newcommand{\xhat}{\widehat{\xvec}}\) \(\newcommand{\vhat}{\widehat{\vvec}}\) \(\newcommand{\uhat}{\widehat{\uvec}}\) \(\newcommand{\what}{\widehat{\wvec}}\) \(\newcommand{\Sighat}{\widehat{\Sigma}}\) \(\newcommand{\lt}{<}\) \(\newcommand{\gt}{>}\) \(\newcommand{\amp}{&}\) \(\definecolor{fillinmathshade}{gray}{0.9}\)Preguntas y consejos relacionados con el gel de agarosa común
(http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/elevate-pcr-research/agarose-content-with-tips-and-tricks.html#2 )
1. ¿Qué porcentaje de agarosa es mejor?
El porcentaje estándar de agarosa utilizado para ejecutar un gel de ADN suele ser de alrededor de 1.0%. Un mayor porcentaje de agarosa mejora la resolución de bandas más pequeñas; por el contrario, un menor porcentaje de agarosa da mejor resolución y separación de bandas de mayor peso molecular. Si se usa el porcentaje incorrecto, puede ser difícil visualizar las bandas de ADN de manera confiable
|
% Gel |
Resolución Óptima/ ADN lineal (kb) |
|
0.5 |
30 a 1.0 |
|
0.75 |
12 a 0.8 |
|
1.0 |
10 a 0.5 |
|
1.2 |
7 a 0.4 |
|
1.5 |
3 a 0.2 |
* Para piezas muy pequeñas, 2% de gel puede ser una opción. ¡Habla con tu instructor al respecto! *
2. ¿Cómo afecta la fundición de gel a la resolución de la banda?
El grosor recomendado para el gel de agarosa es de 3—4 mm; un gel más grueso de 5 mm dará como resultado bandas borrosas y mayor fondo de tinción. De manera similar, la cantidad de tampón de funcionamiento para cubrir el gel en un aparato de electroforesis es de 3—5 mm. Demasiado tampón disminuirá la movilidad del ADN y causará distorsión de banda. El grosor del peine también es importante y afecta significativamente la resolución. Un peine delgado (1 mm) da bandas muy bien definidas, mientras que un peine grueso da bandas gruesas que conducen a una resolución reducida.
3. Cuánto ADN ejecutar (Menos es mejor)
La cantidad mínima de ADN que puede detectarse depende de las manchas utilizadas. La cantidad máxima de ADN en una banda que aún es clara y bien definida es de aproximadamente 100 ng.
4. ¿Cuál es el tampón adecuado para su electroforesis en gel de agarosa?
Los dos tipos más populares de tampones para ejecutar geles de agarosa son el Tris-acetato con EDTA (TAE) y el Tris-borato con EDTA (TBE). Para ADN pequeño (<1000 pb), y si no hay plan para extraer el ADN, entonces se recomienda 1x tampón TBE. El tampón TBE tiene una alta fuerza iónica y capacidad de amortiguación. El tampón TAE, junto con una baja intensidad de campo (1—2 V/cm), se prefiere para separar ADN grande (12—15 kb). El tampón TAE interactúa con agarosa, lo que resulta en menor electroendosmosis, mayor tamaño de poro aparente y menor intensidad de campo en comparación con los geles de agarosa en tampón TBE. Se debe agregar búfer al GEL.
5. ¿Por qué veo tantas bandas?
Normalmente, el ADN sin cortar parecerá correr más rápido que los plásmidos completamente linealizados. El plásmido aislado y sin cortar debe estar en la forma superenrollada. El uso de enzimas de restricción linealizará nuestros plásmidos.
(http://bitesizebio.com/13524/how-to-identify-supercoils-nicks-and-circles-in-plasmid-preps/)
Cómo identificar superbobinas, mellas y círculos en las preps plasmídicas
Escalera de ADN (Morada de Carga Rápida 1kb Plus Escalera de ADN, New England Biolabs)
