27.6: Secuenciación de ADN

Discutiremos un método de lectura de la secuencia de ADN. Este método, desarrollado por Sanger le valió un segundo premio Nobel. Para secuenciar una pieza de ADN monocatenaria, se sintetiza la cadena complementaria. Se configuran cuatro mezclas de reacción diferentes. Cada uno contiene los 4 desoxinucleótidos radiactivos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) requeridos para la reacción y ADN polimerasa. Además, se agrega didesoxiATP (ddATP) a un tubo de reacción. El dATP y ddATP se unen aleatoriamente al extremo 3' en crecimiento de la cadena complementaria. Si se añade ddATP no se pueden añadir más nucleótidos después ya que su extremo 3' tiene una H y no un OH. Por eso lo llaman dideoxi. Se termina la nueva cadena.. Si se agrega dATP, la cadena continuará creciendo hasta que sea necesario agregar otra A. De ahí que se hará una serie completa de fragmentos discretos de cadenas de ADN, todos terminados cuando se agregó ddATP. El mismo escenario ocurre para los otros 3 tubos, que contienen dCTP y ddCTP, dTTP y ddTTP, y dGTP y ddGTP respectivamente. Todos los fragmentos hechos en cada tubo se colocarán en carriles separados para electroforesis, donde los fragmentos se separarán por tamaño.

Didexonucleótidos

Figura: Didexonucleótidos

Ejemplo

Pretenderá secuenciar una pieza de ADN monocatenaria como se muestra a continuación. Los nuevos nucleótidos son añadidos por la enzima ADN polimerasa al cebador, GACT, en la dirección 5' a 3'. Usted configurará 4 tubos de reacción, Cada tubo contiene todos los DxTp's. Además, agregue ddATP al tubo 1, ddTTP al tubo 2, ddCTP al tubo 3 y ddGTP al tubo 4. Para cada mezcla de reacción separada, determine todas las secuencias posibles hechas escribiendo las posibles secuencias en una de las secuencias complementarias inacabadas a continuación. Corte las secuencias completadas de la página, determine el tamaño de las secuencias de polinucleótidos realizadas y colóquelas como migrarían (según el tamaño) en el carril apropiado de un gel imaginario que haya dibujado en una hoja de papel. El carril 1 contendrá los nucleótidos hechos en el tubo 1, etc. luego dibuje líneas debajo de las posiciones de los nucleótidos recortados para representar bandas de ADN en el gel. Leer la secuencia del ADN complementario sintetizado. Después escribir la secuencia del ADNss que se iba a secuenciar.

• 5' T C A A C G A T C T G A 3' (DE PIE A SECUENCIA)
• 3' G A C T 5' (cebador)
• 3' G A C T 5' (cebador)
• 3' G A C T 5' (cebador)
• 3' G A C T 5' (cebador)
• 3' G A C T 5' (cebador)
• 3' G A C T 5' (cebador)
• 3' G A C T 5' (cebador)
• 3' G A C T 5' (cebador)

Dado que los fragmentos de ADN no tienen color detectable, no se pueden visualizar directamente en el gel. Se utilizan métodos alternativos. En el descrito anteriormente, se utilizaron ddxTP radiomarcados. Una vez que se ejecuta el gel de secuenciación, se puede secar y visualizar las bandas mediante radioautografía (también llamada autorradiografía). Se coloca un lugar de película de rayos X sobre el gel seco en un ambiente oscuro. Las bandas radiomarcadas emitirán radiación que expondrá la película de rayos X directamente sobre las bandas. La película se puede desarrollar para detectar las bandas. En una técnica más nueva, la imprimación se puede etiquetar con un tinte fluorescente. Si se usa un colorante diferente para cada mezcla de reacción, todas las mezclas de reacción se pueden ejecutar en un carril de un gel. (En realidad, solo se necesita realizar una mezcla de reacción que contenga todos los ddxTP juntos). El gel puede entonces ser escaneado por un láser, que detecta la fluorescencia de los colorantes, cada uno a una longitud de onda diferente.

Figura: Secuenciación de ADN usando diferentes cebadores fluorescentes para cada reacción ddxTP

Un avance reciente en la secuenciación permite la determinación en tiempo real de una secuencia. Los cuatro desoxinucleótidos están marcados cada uno con un fluorforo diferente en el fosfato 5' (no la base como anteriormente). Una ADN polimerasa anclada alarga el ADN sobre un molde, liberando el fluoróforo en solución (es decir, el fluoróforo no se incorpora a la cadena de ADN). La reacción se realiza en una cámara de visualización llamada guía de ondas en modo cero que es una cámara metálica cilíndrica con una anchura de 70 nm y un volumen de 20 zeptolitros (20 x 10-21 L). Se asienta sobre un soporte de vidrio a través del cual se logra la iluminación láser de la muestra. Dado el pequeño volumen, los desoxinucleótidos marcados fluorescentemente no incorporados difunden dentro y fuera en la escala de tiempo de microsegundos. Cuando se incorpora un desoxinucleótidos al ADN, su tiempo de residencia está en la escala de tiempo de milisegundos. Esto permite una detección prolongada de fluorescencia que proporciona una alta relación señal/ruido. Este método podría reducir el costo de secuenciar el genoma humano desde el rango inicial de mil millones de dólares a 100 dólares.