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7.4: Ejercicio 2 - Predecir los tamaños de los productos de PCR

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    En el siguiente laboratorio, analizarás tus productos de reacción PCR en un gel de agarosa que separa las moléculas de ADN de acuerdo a sus tamaños. Para interpretar esos resultados, será importante haber calculado los tamaños esperados de los productos de PCR a partir de sus reacciones. Para ayudar a esos cálculos, prepare un mapa simple de la región genómica que contiene su gen con las secuencias del cebador alineadas contra la secuencia del genoma. Todos los productos de PCR deben contener una porción de la región flanqueante 5' del gen MET debido al cebador A. Un producto de PCR puede o no contener porciones del CDS del gen MET, dependiendo de si está analizando una cepa con el gen MET nativo o alterado. Para construir tu mapa, puedes aprovechar los registros especiales de secuencias genómicas preparados por los curadores de SGD. Estos registros contienen el CDS para su gen MET junto con 1 kb de secuencia aguas arriba y 1 kb de secuencia aguas abajo. Los curadores de SGD generaron estos registros porque a menudo los investigadores están interesados en estudiar elementos reguladores que controlan la transcripción de un gen y el procesamiento de las transcripciones génicas. En S. cerevisiae, estos elementos reguladores suelen ubicarse dentro de 1 kb del CDS.

    A es 357 nucleótidos aguas arriba del codón de iniciación SAM1 (nucleótido 1001). Los productos anclados al cebador B agregan 280 pb de CDS al producto de PCR. El tamaño esperado del producto de PCR es 357 + 280 pb, o 637 pb. Si la cepa de deleción hubiera sido utilizada para PCR, los cebadores SAM1 A y B no generarían un producto de PCR. En su lugar, el cebador A de SAM1 y el cebador B de KAN R generarían un producto de 607 pb (357 + 250), debido a que el cebador B de KAN R se une a los nucleótidos 231-250 del KAN R CDS .

    Necesitarás dos ventanas de navegador para este ejercicio. Cada miembro del grupo debe trabajar con un solo gen.

    Encuentra la secuencia genómica para tu gen.

    • Navegue hasta la página de resumen de su gen en el SGD (yeastgenome.org)
    • Haga clic en la pestaña Secuencia en la parte superior de la página de resumen.
    • Cursor hacia abajo a la secuencia génica para S288C. Seleccione “Secuencia genómica +/- 1kb” en el cuadro desplegable.
    • Anote debajo de las coordenadas inicial y final de la secuencia y calcule la longitud de la secuencia. (Debería ver el codón de inicio ATG en los nucleótidos 1001-1003.)

    Longitud de la secuencia (pb) __________

    Longitud de la secuencia codificante ___________

    Alinee las secuencias del cebador con la secuencia genómica.

    Para encontrar la posición sobre los cebadores en la secuencia genómica, utilizaremos la herramienta BLAST de NCBI. BLAST significa Herramienta de búsqueda de alineación local básica y se puede usar para alinear secuencias de proteínas o ácidos nucleicos. Aprenderás más sobre los algoritmos BLAST en el Capítulo 9.

    • Dirija su navegador al sitio de NCBI y seleccione BLAST en la lista de recursos de la derecha.
    • Seleccione Nucleotide BLAST en la lista de programas BLAST básicos.
    • Haga clic en la casilla “Alinear dos o más secuencias”. Copiar la “secuencia genómica +/- 1kb” de

      SGD y pegue la secuencia en el cuadro Secuencia de Sujeto inferior.

    • Escriba la secuencia del cebador A para su gen en el cuadro de consulta.
    • Ajuste el algoritmo BLAST para una secuencia corta. Las secuencias de cebadores que estamos usando

      tienen 25 nucleótidos de longitud. Esto es más corto que el valor predeterminado de 28 para “palabras” en BLASTN (el algoritmo para comparar secuencias de nucleótidos). BLAST no alineará dos secuencias si la coincidencia es menor a 28 nucleótidos. Expanda los “parámetros del algoritmo” en la parte inferior de la página. Seleccione un “tamaño de palabra” inferior a 28.

    • Haga clic en BLAST. Los resultados de BLAST muestran una tabla que muestra cada coincidencia entre su cebador y la secuencia del genoma. El resultado superior debe ser una combinación perfecta entre su cebador y la secuencia del genoma. (¡Comprueba tu escritura si no es una combinación perfecta!) Registrar los nucleótidos inicial y final en la secuencia de ADN genómico donde coincide con la secuencia del cebador.
    • Repita la alineación BLAST para el cebador B. Haga clic en “Editar y volver a enviar” en la parte superior de la página de resultados BLAST. Desmarque el cuadro de consulta y escriba la secuencia del cebador B. Haga clic en BLAST y registre los resultados de la alineación. En los resultados, se observa que los números de nucleótidos del cebador son ascendentes, mientras que los números de nucleótidos del ADN genómico están en orden descendente. Esto se debe a que la secuencia del cebador B es el complemento inverso de la secuencia génica.

      Dibuje un mapa de los sitios de unión de su gen y cebador en el espacio de abajo. Incluir el codón de inicio y las distancias en pb.

    Calcular los tamaños de los productos de PCR que se generarían con:

    Imprimación A e Imprimación B

    Imprimación A y KAN R cebador B


    This page titled 7.4: Ejercicio 2 - Predecir los tamaños de los productos de PCR is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.