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10.3: Los plásmidos se aíslan fácilmente de las células bacterianas

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    El aislamiento plasmídico aprovecha las propiedades estructurales únicas de los plásmidos. Los plásmidos son pequeños trozos circulares superenrollados de ADN. A diferencia del cromosoma bacteriano mucho más grande (que también es circular), los plásmidos son bastante resistentes a la desnaturalización permanente. Hoy en día, la mayoría de los laboratorios utilizan kits comerciales para aislamientos de plásmidos, debido a que los kits son convenientes y relativamente económicos. Los kits dan buenos rendimientos de ADN de alta calidad, al tiempo que evitan la necesidad de desnaturalizantes orgánicos. Se ha descrito una variedad de procedimientos menos costosos, pero algo más largos, para los investigadores que desean hacer sus propios reactivos. Estos últimos procedimientos generalmente dan buenos rendimientos de ADN, pero el ADN suele ser menos puro que el ADN aislado con kits. Cualquiera que sea el procedimiento de aislamiento, los principios generales del aislamiento plasmídico son los mismos.

    La figura y los párrafos de la página opuesta resumen los pasos y principios generales utilizados para el aislamiento de plásmidos.

    10-isolation.jpg

    1. Lisis y desnaturalización - Se utilizan fuertes condiciones desnaturalizantes para debilitar la dura pared celular bacteriana. Los procedimientos más comunes utilizan una combinación de base fuerte y un detergente. Los detergentes ayudan a solubilizar los lípidos en la pared celular, permitiendo que los desnaturalizantes ingresen a la célula. Las proteínas, por sus frágiles estructuras, se desnaturalizan irreversiblemente. El tratamiento también rompe los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de las hélices de ADN.
    2. Neutralización - La neutralización permite que las cadenas de ADN complementarias vuelvan a aparearse y hace que las proteínas precipiten. Los plásmidos renaturalizan porque tienen estructuras superenrolladas que han mantenido unidas las dos hebras de la hélice durante la desnaturalización. Sin embargo, el ADN cromosómico no es capaz de renaturalizarse debido a que sus cadenas más largas se han mezclado con proteínas desnaturalizadas. Las muestras deben mezclarse suavemente en esta etapa para evitar la fragmentación del ADN cromosómico largo en trozos que podrían reaparearse y co-purificar con los plásmidos.
    3. Centrifugación - El ADN plasmídico se separa de grandes agregados de proteínas precipitadas y ADN cromosómico por centrifugación.
    4. Purificación adicional - Los plásmidos se purifican adicionalmente mediante extracción orgánica o adsorción a una resina.

    Los plásmidos con los que estamos trabajando en este laboratorio se han mantenido en una cepa de laboratorio de Escherichia coli. E. coli es una proteobacteria que habita normalmente el tracto intestinal de mamíferos de sangre caliente. Las cepas virulentas de E. coli que aparecen en las noticias han adquirido, muchas veces por transferencia lateral de genes, islas de patogenicidad que contienen genes para factores de virulencia, tox- ins y proteínas de adhesión importantes para la invasión tisular. Las islas de patogenicidad no están presentes en cepas de laboratorio, las cuales son derivados de la cepa K12 de E. coli. K12 es una cepa debilitada que es incapaz de colonizar el intestino humano. Se ha propagado y utilizado de manera segura en el laboratorio por más de 70 años. Las cepas de E. coli utilizadas en biología molecular también han sido seleccionadas para tolerar un gran número de plásmidos.

    Utilizaremos el kit ZyppyTM (Zymo Research) para purificar plásmidos de las cepas transformadas de E. coli. La etapa de purificación final en el procedimiento implica una columna de centrifugación de resina de sílice. Los ácidos nucleicos se unen fuertemente a la sílice en presencia de altas concentraciones de sal. Después de una etapa de lavado que elimina cualquier proteína residual, los plásmidos se eluyen con una solución baja en sal. Las soluciones plasmídicas son muy estables y pueden almacenarse durante largos periodos de tiempo en el refrigerador o congelador.


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