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10.4: Ejercicio 1 - Aislamiento de plásmidos con el kit ZyppyTM

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    Obtener las células bacterianas portadoras de plásmidos

    1. Recoge los tres cultivos bacterianos que tu grupo ha sido asignado. Las bacterias han sido transformadas con plásmidos que contienen un gen MET de S. cerevisiae, su ortólogos de S. pombe o lacZ bacteriano. Cada cultivo contiene 0.6 mL de medio Luria Bertani (LB) con 100 μg/mL de ampicilina. Los cultivos se cultivaron durante la noche a 37 grados C, y se espera que la densidad celular sea 3-4 X 109 células/ml.

    ¿Cuál es el propósito de la ampicilina? ¿Cómo funciona?

    Lisis alcalina de células bacterianas que albergan los plásmidos

    2. Agrega 100 μL de tampón de lisis Blue Zyppy 7X al tubo. Mezcle el tampón y las células invirtiendo suavemente el tubo 4-6 veces. ¡Sé gentil! Demasiado estrés mecánico podría fragmentar el ADN cromosómico bacteriano y contaminar su preparación plasmídica. La solución debe pasar de un azul turbio a un azul claro.

    NOTA: ¡Este paso es sensible al tiempo! Se procedió al siguiente paso en 2 minutos.

    Separar el ADN plasmídico de las proteínas desnaturalizados y el ADN cromosómico

    3. Agregue 350 μL de tampón de neutralización Zyppy Amarillo frío (W/ARNasa A) al tubo y mezcle bien el contenido invirtiéndolo varias veces. La solución se volverá amarilla cuando se complete la neutralización y se formará un precipitado amarillento. Invertir la muestra 3-4 veces adicionales para asegurar la neutralización completa. Asegúrate de que no haya más color azul.

    4. Centrifugar la mezcla a velocidad máxima durante 3 minutos para eliminar las proteínas desnaturalizadas y el ADN cromosómico. Observe que el tubo contiene un precipitado blanco que se ha recogido en un lado del tubo. El sobrenadante amarillo pálido contiene el ADN plasmídico.

    Purificar el ADN plasmídico por adsorción a una resina de sílice.

    5. Usando una pipeta, transfiera cuidadosamente el sobrenadante amarillo pálido (~900 μL) a una columna de centrifugación Zyppy. ¡Ten cuidado de no transferir ninguno de los precipitados amarillos! Etiquete la columna - NO el tubo de recolección que utilizará en el siguiente paso.

    6. Colocar la columna con el tubo de recolección unido a una centrífuga y centrifugar a velocidad máxima durante ~ 1 minuto.

    7. Retire la columna y deseche el flujo a través del tubo de recolección.

    8. Vuelva a colocar la columna en el tubo de recolección y agregar 200 μL de solución Zyppy Endo-Wash. (Endo-Wash contiene clorhidrato de guanidina e isopropanol, lo que eliminará las proteínas desnaturalizadas de la resina).

    9. Centrifugar durante ~1 minuto y desechar el flujo a través.

    10. Vuelva a colocar la columna en el tubo de recolección y luego agregar 400 μL de tampón de lavado de columna Zyppy. (Este paso elimina las sales contaminantes). Centrifugar por ~1 minuto. Vacíe el tubo colector.

    11. Repita el paso de centrifugación para eliminar cualquier etanol residual.

    Eluir el ADN plasmídico

    12. Transfiera la columna Zyppy a un tubo de centrífuga limpio (y debidamente etiquetado) de 1.5 mL, dejando abierta la tapa del tubo.

    13. Con cuidado, agregue 100 μL de tampón de elución directamente en la parte superior del lecho de la columna blanca. Coloca la punta de la pipeta lo más cerca que puedas del lecho de la columna blanca sin pincharla. Dispensar lentamente el tampón en la parte superior del lecho de resina.

    14. Permita que el tampón se filtre en la columna dejando que la columna se asiente en el tubo de microcentrífuga durante 1 minuto.

    15. Centrifugar la columna a velocidad máxima durante 30 segundos. Nuevamente, está bien dejar la tapa abierta durante este giro.

    16. Retire la columna, tape el tubo y colóquelo sobre hielo. Este tubo debería contener ahora ADN plasmídico. Etiquete el tubo. GUARDAR el ADN para futuros experimentos.


    This page titled 10.4: Ejercicio 1 - Aislamiento de plásmidos con el kit ZyppyTM is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.