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15.4: Las transferencias Western implican muchos pasos

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    En un procedimiento de transferencia Western, las proteínas se separan primero en un gel SDS-PAGE y luego se transfieren a una membrana. Esta réplica de membrana se trata con anticuerpos que reconocen específicamente una proteína o epítopo de interés. Las etapas de procesamiento adicionales generan una señal en la posición del anticuerpo unido. Entre los pasos, se realizan varios lavados para aumentar la relación señal/ruido en la mancha final desarrollada. Los pasos principales en una típica mancha western se esquematizan en la siguiente página y se discuten con mayor detalle en las secciones que siguen:

    • Transferencia electroforética de proteínas de un gel SDS-PAGE a una membrana
    • Bloqueo de sitios de unión a proteínas inespecíficos en membranas de transferencia
    • Incubación de la membrana con un anticuerpo primario específico para el epítopo de interés
    • Incubación con un anticuerpo secundario que reconoce anticuerpos primarios
    • Visualización de anticuerpos unidos

    Transferencia electroforética de proteínas de un gel SDS-PAGE a una membrana

    El primer paso en una transferencia Western es generar una réplica del gel SDS-PAGE transfiriendo proteínas electroforéticamente a una membrana sintética con una alta capacidad de unión a proteínas. En nuestros experimentos, utilizaremos membranas hechas de fluoruro de polivinilidina (PVDF), una especie de plástico. Las membranas PVDF son hidrofóbicas y las membranas secas no se humedecen adecuadamente con agua. Por lo tanto, las membranas de PVDF se humedecen primero con metanol, luego se enjuagan con agua desionizada y finalmente se enjuagan con tampón de transferencia. No se debe permitir que se sequen durante los procedimientos de transferencia e inmunotransferencia. Si se secan, deben volver a humedecerse con metanol y enjuagarse con agua antes de proceder.

    15-blot.jpg

    Durante el proceso de transferencia, el gel y la membrana se colocan directamente uno contra el otro dentro de un “sándwich” de papeles de filtro prehúmedos y almohadillas de espuma (ver la figura a continuación). Durante la transferencia electroforética, la corriente debe fluir uniformemente a través de toda la superficie del gel. Es importante, por lo tanto, que las burbujas de aire no queden atrapadas entre el gel y la membrana. Después de la transferencia electroforética, que se puede hacer en pocas horas o durante la noche con voltaje reducido, la réplica de membrana con las proteínas transferidas se puede dejar secar y almacenar para su posterior visualización con anticuerpos.

    Bloqueo de sitios de unión a proteínas no específicos en membranas

    Las membranas de transferencia utilizadas en las transferencias Western se unen a proteínas de forma no específica. Antes de incubar las membranas con anticuerpos específicos (y costosos), deben pretratarse con soluciones bloqueantes que contengan altas concentraciones de proteínas abundantes (y baratas) para saturar sitios de unión no específicos. Piense en este paso como análogo a que un artista imprima un lienzo con una pintura de menor calidad antes de que se aplique el medio más caro. Si las membranas de transferencia no se bloquean adecuadamente antes de aplicar el anticuerpo, los sitios inespecíficos en las membranas absorberán algunos de los anticuerpos, reduciendo la cantidad de anticuerpo disponible para unirse a las proteínas
    diana. En nuestros experimentos, utilizaremos proteínas de caseína de la leche como reactivos de bloqueo. Debido a que nuestros experimentos no requieren de alta sensibilidad, leche en polvo desnatada rehidratada (¡directamente de la tienda de abarrotes!) es una fuente adecuada de caseínas.

    Fijación de anticuerpos primarios

    Se pueden usar anticuerpos policlonales o monoclonales como anticuerpo primario en transferencias Western. Los anticuerpos pueden dirigirse hacia una proteína de origen natural o hacia un epítopo unido a una proteína sobreexpresada (como estamos haciendo). Cada vez más, los investigadores están utilizando proteínas etiquetadas con epítopos en sus experimentos, porque los anticuerpos contra las proteínas naturales son costosos y requieren mucho tiempo de prepararse. Además, se puede usar un anticuerpo dirigido contra un epítopo para detectar muchas proteínas diferentes que portan ese mismo epítopo. En nuestras transferencias Western, utilizaremos un anticuerpo monoclonal de ratón que se une al epítopo V5 en las proteínas Met y lacZ expresadas a partir del plásmido pYES2.1.

    Fijación secundaria de anticuerpos

    Los anticuerpos secundarios utilizados en las transferencias Western están diseñados para unirse a los fragmentos FC
    de anticuerpos primarios, aprovechando las diferencias entre especies en las secuencias de anticuerpos. Los antisueros secundarios generalmente se preparan inyectando a un animal fragmentos FC de IgG de una segunda especie. El primer animal reconoce los fragmentos de FC como antígenos extraños y produce anticuerpos que se unen a los fragmentos de FC. El anticuerpo secundario en nuestro experimento es un anticuerpo policlonal de conejo preparado contra los dominios FC de IgG de ratón. El anticuerpo se unirá a los dominios FC de los anticuerpos anti-V5 de ratón unidos a las proteínas codificadas por pYES2.1.

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    Visualización del anticuerpo unido

    En esta etapa final, la transferencia Western se incuba con sustratos para la enzima que se ha conjugado con el anticuerpo secundario. Nuestro anticuerpo secundario ha sido conjugado a HRP, una enzima resistente con un alto número de recambio. (El número de recambio es el número de moléculas de producto producidas en el sitio activo de una enzima por segundo). HRP cataliza la reacción de peróxido de hidrógeno y 3,3',5,5' - tetrametilbencidina (TMB), lo que genera un producto de reacción azul oscuro- gris que precipita en el sitio de reacción en la transferencia Western. El producto de reacción coloreado se acumula con el tiempo hasta que la reacción se detiene lavando el sustrato sin reaccionar. La reacción debe terminarse antes de que la unión inespecífica de anticuerpos se vuelva problemática, como lo demuestra la aparición de muchas bandas de tinción débil.


    This page titled 15.4: Las transferencias Western implican muchos pasos is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.