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7.6: Procesamiento de ARN

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    Fuente: BiochemFFA_7_5.pdf. Todo el libro de texto está disponible gratuitamente de los autores en http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy

    Hasta el momento, hemos mirado el mecanismo por el cual la información en los genes (ADN) se transcribe en ARN. El ARN recién hecho, también conocido como transcripción primaria, se procesa adicionalmente antes de que sea funcional. Tanto procariotas como eucariotas procesan sus ARN ribosómicos y de transferencia. La principal diferencia en el procesamiento del ARN, sin embargo, entre procariotas y eucariotas, está en el procesamiento de los ARN mensajeros. Nos centraremos en el procesamiento de los ARNm en esta sección. Recordarás que en las células bacterianas, el ARNm se traduce directamente ya que sale del molde de ADN. En las células eucariotas, la síntesis de ARN, que ocurre en el núcleo, se separa de la maquinaria de síntesis de proteínas, que se encuentra en el citoplasma. El producto inicial de la transcripción de un ARNm a veces se denomina pre-ARNm. Después de que se haya procesado y esté listo para ser exportado desde el núcleo, se le llama ARNm maduro. Los tres pasos principales de procesamiento para los ARNm son (Figura 7.67):

    • Tapado en el extremo 5'
    • Empalme para eliminar intrones
    • Adición de una cola de poliA en el extremo 3'.

    Aunque esta descripción sugiere que estas etapas de procesamiento ocurren postranscripcionalmente, después de que todo el gen ha sido transcrito, existe evidencia de que el procesamiento ocurre co-transcripcionalmente. Es decir, las etapas de procesamiento se están produciendo a medida que se está haciendo el ARNm. Se ha demostrado que las proteínas involucradas en el procesamiento del ARNm están asociadas con el dominio C-terminal fosforilado (CTD) de la ARN polimerasa II.

    Tapado

    Como cabría esperar, la adición de una caperuza de ARNm en el extremo 5' es el primer paso en el procesamiento del ARNm, ya que el extremo 5' del ARN es el primero en hacerse. La caperuza ocurre una vez que se han sintetizado los primeros 20-30 nucleótidos del ARN. La adición de la tapa implica la eliminación de un fosfato del primer nucleótido en el ARN para generar un difosfato. Este se une luego a un monofosfato de guanosina que posteriormente se metila en N7 de la guanina para formar la estructura de tapa de 7mg (Figura 7.68). Esta caperuza es reconocida y unida por un complejo de proteínas que permanecen asociadas con la caperuza hasta que el ARNm ha sido transportado al citoplasma. La tapa protege el extremo 5' del ARNm de la degradación por nucleasas y también ayuda a posicionar el ARNm correctamente en los ribosomas durante la síntesis de proteínas.

    Empalme

    Los genes eucariotas tienen intrones, regiones no codificantes que interrumpen el gen. Por lo tanto, el ARNm copiado de genes que contienen intrones también tendrá regiones no codificantes que interrumpen la información en el gen. Estas regiones no codificantes deben eliminarse (Figura 7.69) antes de que el ARNm se envíe fuera del núcleo para ser utilizado para dirigir la síntesis de proteínas.

    Eliminación de intrones

    Los intrones se eliminan del pre-ARNm por la actividad de un complejo llamado spliceosoma. El spliceosoma está formado por proteínas y pequeños ARN que se asocian para formar enzimas proteína-ARN llamadas ribonucleoproteínas nucleares pequeñas o snRNP (roncos pronunciados).

    Empalme

    La maquinaria de corte y empalme debe ser capaz de reconocer las uniones de empalme (es decir, donde termina cada exón y comienza su intrón asociado) para cortar correctamente los intrones y unir los exones para hacer el ARNm maduro y empalmado. ¿Qué señales indican límites exón-intrón? Las uniones entre exones e intrones están indicadas por secuencias de bases específicas. La secuencia consenso en la unión exón-intrón 5' (también llamada sitio de empalme 5') es AGGURAGU. En esta secuencia, el intrón comienza con la segunda G (R significa cualquier purina). La unión de empalme 3' tiene la secuencia consenso YAGRNNN, donde YAG está dentro del intrón, y RNNN es parte del exón (Y representa cualquier pirimidina y N para cualquier nucleótido).

    También hay una tercera secuencia importante dentro del intrón, alrededor de cien nucleótidos del sitio de empalme 3', llamada punto de ramificación o sitio de ramificación, que es importante para el corte y empalme. Este sitio se define por la presencia de una A seguida de una cadena de pirimidinas. La importancia de este sitio se verá cuando consideremos los pasos del empalme.

    Mecanismo de empalme

    Hay dos pasos principales en el empalme. El primer paso es el ataque nucleofílico por el 2'OH del punto de ramificación A en el sitio de empalme 5' (la unión del exón 5' y el intrón). Como resultado de una reacción de transesterificación, se libera el exón 5' y se genera una molécula en forma de lazo compuesta por el exón 3' y la secuencia del intrón (Figura 7.70). En la segunda etapa, el OH 3' del exón 5' ataca el sitio de corte y empalme 3', y los dos exones se unen entre sí, y se libera el intrón en forma de lazo.

    Empalmeosoma

    Como se mencionó anteriormente, el empalme se lleva a cabo mediante un complejo que consiste en pequeños ARN y proteínas. Los cinco ARN pequeños cruciales para este complejo, U1, U2, U4, U5 y U6 se encuentran asociados con proteínas, como snRNP. Estas y muchas otras proteínas trabajan juntas para facilitar el empalme. Aunque quedan muchos detalles por resolver, parece que los componentes de la maquinaria de corte y empalme se asocian con el CTD de la ARN polimerasa y que esta asociación es importante para un corte y empalme eficiente. El ensamblaje del spliceosoma requiere la interacción escalonada de los diversos snRNP y otros factores de empalme (Figura 7.71). La etapa inicial en este proceso es la interacción del snRNP U1 con el sitio de corte y empalme 5'. También se cargan proteínas adicionales como U2AF (AF = factor asociado) en el pre-ARNm cerca del sitio de la ramificación. Esto es seguido por la unión del ARNsn U2 al sitio de la ramificación.

    A continuación, se recluta un complejo de los snRNP U4/U6 y U5 al spliceosoma para generar un complejo precatalítico. Este complejo sufre reordenamientos que alteran las interacciones ARN-ARN y proteína-ARN, dando como resultado el desplazamiento de los snRNP U4 y U1 y la formación del spliceosoma catalíticamente activo. Este complejo luego lleva a cabo los dos pasos de empalme descritos anteriormente.

    Empalme alternativo

    En promedio, los genes humanos tienen alrededor de 9 exones cada uno. Sin embargo, los ARNm maduros de un gen que contiene nueve exones pueden no incluir todos ellos. Esto se debe a que los exones en un pre-ARNm se pueden empalmar juntos en diferentes combinaciones para generar diferentes ARNm maduros. Esto se llama empalme alternativo, y permite la producción de muchas proteínas diferentes usando relativamente pocos genes, ya que un solo ARN con muchos exones puede, al combinar diferentes exones durante el corte y empalme, crear muchos mensajes de codificación de proteínas diferentes. Debido al corte y empalme alternativo, cada gen en nuestro ADN da lugar, en promedio, a tres proteínas diferentes. El corte y empalme alternativo permite que la información en un solo gen sea utilizada para especificar diferentes proteínas en diferentes tipos de células o en diferentes etapas de desarrollo (Figura 7.72).

    Poliadenilación

    “El extremo 3' de un ARNm eucariota procesado normalmente tiene una “" cola poli (A) "” que consiste en aproximadamente 200 nucleótidos que contienen adenina.” Estos residuos son añadidos por una enzima independiente del molde, la poli (A) polimerasa, después de la escisión del ARN en un sitio cercano al extremo 3' del nuevo transcrito. Se ha demostrado que los componentes de la maquinaria de poliadenilación están asociados con el CTD de la ARN polimerasa, lo que demuestra que las tres etapas del procesamiento del pre-ARNm están estrechamente ligadas a la transcripción. Existe evidencia de que la cola de poliA juega un papel en la traducción eficiente del ARNm, así como en la estabilidad del ARNm. Al igual que los sitios de empalme alternativos, los genes también pueden tener sitios poliA alternativos (Figura 7.73).

    La caperuza y la cola de poliA en un ARNm también son indicaciones de que el ARNm está completo (es decir, no defectuoso). Una vez procesados los mensajes de codificación de proteínas mediante el tapado, empalme y adición de una cola de poli A, son transportados fuera del núcleo para traducirlos en el citoplasma. Los ARNm maduros se envían al citoplasma unidos a proteínas exportadoras que interactúan con los complejos de poro nuclear en la envoltura nuclear (Figura 7.74). Una vez que el ARNm maduro ha sido translocado al citoplasma, está listo para ser traducido.

    Edición de ARN

    Además de someterse a las tres etapas de procesamiento descritas anteriormente, muchos ARN experimentan una modificación adicional llamada edición de ARN. La edición se ha observado no solo en ARNm sino también en ARN de transferencia y ARN ribosómicos. Como su nombre indica, la edición de ARN es un proceso durante el cual la secuencia del transcrito se altera postranscripcionalmente. Un ejemplo bien estudiado de edición de ARN es la alteración de la secuencia del ARNm para la apolipoproteína B (ver también AQUÍ). La edición da como resultado la desaminación de una citosina en el transcrito para formar un uracilo, en una ubicación específica en el ARNm. Este cambio convierte el codón en esta posición, CAA, que codifica una glutamina, en UAA, un codón de parada. La consecuencia de esto es que se hace una versión más corta de la proteína, cuando se traduce la transcripción editada. Es interesante que la edición de esta transcripción ocurra en las células intestinales pero no en las células hepáticas. Así, el producto proteico del gen de la apolipoproteína B es más largo en el hígado que en el intestino.

    Inserción/eliminación

    Otro tipo de edición de ARN implica la inserción o deleción de uno o más nucleótidos. Un ejemplo de este tipo de edición se ve en los ARN mitocondriales de los tripanosomas. Los ARN guía pequeños indican los sitios en los que se insertan o eliminan los nucleótidos para producir el ARNm que finalmente se traduce (Figura 7.75).

    El efecto de cualquiera de estos tipos de edición sobre el ARNm es que el producto proteico codificado es diferente, proporcionando otro punto en el que se puede controlar el producto de expresión de un gen.

    Síntesis y procesamiento de ARNt

    Los ARNt son sintetizados por la ARN polimerasa III, que produce moléculas precursoras llamadas pre-ARNt que luego se someten a procesamiento para generar ARNt maduros. Los transcritos iniciales contienen secuencias de ARN adicionales en los extremos 5' y 3'. Algunos pre-ARNt también contienen intrones. Estas secuencias adicionales se eliminan de la transcripción durante el procesamiento.

    La secuencia líder 5' del pre-ARNt (los nucleótidos adicionales en el extremo 5') se elimina mediante una endonucleasa inusual llamada ribonucleasa P (RNasa P - Figura 7.76). La RNasa es un complejo ribonucleoproteico compuesto por un ARN catalítico y numerosas proteínas. La secuencia del remolque 3' (nucleótidos adicionales en el extremo 3' del pre-ARNt) se elimina posteriormente por diferentes nucleasas. Todos los ARNt deben tener una secuencia 3' CCA que sea necesaria para la carga de los ARNt con aminoácidos. En bacterias, esta secuencia de CCA está codificada en el gen ARNt, pero en eucariotas, la secuencia de CCA se agrega postranscripcionalmente por una enzima llamada ARNt nucleotidiltransferasa (tRt).

    Intrones

    Como se mencionó anteriormente, algunos precursores de ARNt contienen un intrón localizado en el brazo anticodón. En eucariotas, este intrón se encuentra típicamente inmediatamente 3' del anticodón. Los intrones se empalman con la ayuda de una endonucleasa de corte y empalme de ARNt y una ligasa.

    Modificaciones de base

    Los ARNt maduros contienen una alta proporción de bases distintas a las habituales adenina (A), guanina (G), citidina (C) y uracilo (U). Estas bases inusuales se producen modificando las bases en el ARNt para formar variantes, como pseudouridina (Figura 7.77) o dihirouridina. Las modificaciones a las bases se introducen en el ARNt en la etapa de procesamiento final por una variedad de enzimas especializadas. Diferentes ARNt tienen diferentes subconjuntos de modificaciones en ubicaciones específicas, a menudo la primera base del anti-codón (la posición de bamboleo).

    Síntesis y procesamiento de ARNr

    Las células contienen muchas copias de genes de ARNr (entre 100 y 2000 copias se ven en células de mamíferos). Estos genes están organizados en unidades de transcripción separadas por espaciadores no transcritos. Cada unidad de transcripción contiene secuencias que codifican ARNr 18S, 5.8S y 28S, y es transcrita por la ARN polimerasa I en un único transcrito largo (47S). El ARNr 5S se transcribe por separado. Los tamaños de los ARN ribosómicos se indican, por convención, por sus coeficientes de sedimentación, que es una medida de su velocidad de sedimentación durante la centrifugación. La sedimentación se expresa en unidades de Svedberg (de ahí la S al final del número) con números mayores que indican mayor masa.

    El transcrito inicial contiene espaciadores transcritos externos 5' y 3' (ETS) así como secuencias transcritas internas (ITS). El transcrito primario se recorta primero en ambos extremos por nucleasas para dar un pre-ARNr 45S. El procesamiento posterior del pre-ARNr a través de escisiones guiadas por complejos ARN-proteína que contienen SNORNA (ARN nucleolares pequeños), da lugar a los ARNr 18S, 5.8S y 28S maduros (Figura 7.79). Los ARN ribosómicos también se modifican tanto en los azúcares de ribosa como en las bases. Curiosamente, la metilación de los azúcares de ribosa es la principal modificación en el ARNr. La pseudouridina de base modificada también es común en el ARNr. Otras modificaciones incluyen metilación de bases y acetilación. Se cree que estas modificaciones son importantes en la modulación de la función ribosómica.

    Procesamiento de Información: Procesamiento de ARN

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    Figura 7.68 - Protección 5' de ARNm eucariotas

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    Figura 7.67 - Etapas en el procesamiento del pre-ARNm

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    Figura 7.69 - Eliminación de intrones de la transcripción primaria

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    Figura 7.70 - Empalme de intrones

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    Figura 7.71 - Ensamblaje del complejo de spliceosoma

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    Figura 7.72 - El corte y empalme alternativo conduce a diferentes formas de una proteína de la misma secuencia génica

    Figura 7.73 - Sitios de poliadenilación alternativos para un gen

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    Figura 7.74 - Estructura de un ARNm eucariota maduro

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    Figura 7.76 - Estructura del componente de ARN de la ribonucleasa P

    Figura 7.75 - Guiado por plantillas - un mecanismo de edición de ARN

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    Figura 7.78 - Secuencia de un ARNt maduro

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    Figura 7.77 - Síntesis de pseudouridina a partir de uridina

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    Figura 7.79 - Procesamiento de ARN ribosómico

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