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2.5.3: Coloración de Zielhl-Neelsen (tinción diferencial para bacterias ácido-alcohol resistentes)

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    Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (ácido alcohol sensibles)

    Procedimiento

    a) Sobre el preparado ya fijado se vierte la solución de fucsina de Ziehl sin diluir.

    b) Se calienta hasta que empiecen a desprenderse vapores blancos, haciendo pasar por debajo del portaobjetos la llama de un hisopo embebido en alcohol. Se repite tres veces el procedimiento.

    c) Dejar enfriar 5 min y lavar con agua.

    d) Decolorar con una solución de ácido clorhídrico al 3% (V/V) en etanol de 95% (mezcla alcohol-ácido), hasta la decoloración casi total del frotis.

    e) Lavar con agua.

    f) Cubrir unos minutos con solución de Azul de Metileno (según Loeffler).

    g) Lavar con agua, secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

    Resultado

    Las bacterias ácido-alcohol resistentes (bacilos de la tuberculosis, lepra y otras Micobacterias) se observan de color rojo sobre el contraste azul de otras células bacterianas o restos celulares

    pertenecientes a los organismos sensibles a esta decoloración ácida (Figura 2.4).

    Fundamento

    Ciertos microorganismos especialmente los del género Mycobacterium (M. tuberculosis, M. leprae, etc.) y Nocardia tienen dificultades para colorearse con las tinciones simples y aún con la de Gram, por lo cual se los denomina bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR).

    Dichos microorganismos contienen una gran cantidad de ceras asociadas a la mureina de la pared celular. Estas ceras (lípidos sólidos) contienen ácidos grasos de cadena muy larga (ácidos micólicos) que serían la causa de la resistencia a los métodos habituales de tinción. Por lo tanto, es necesario usar una alta concentración del colorante primario (fucsina de Ziehl o carbolfucsina) y aplicar calor suave sobre la preparación (el calentamiento derrite la cera y aumenta la penetración y la retención del colorante). A continuación el extendido se trata con ácido-alcohol, un decolorante que elimina el color rojo de las bacterias que no son ácido- alcohol resistentes. Los BAAR retienen el color rojo porque las ceras vuelven a solidificarse al enfriarse y por lo tanto, no actúa el decolorante. Las células que no son ácido-alcohol resistentes permanecerán incoloras hasta que se coloree el extendido con azul de metileno, que actúa como colorante de contraste. Las bacterias que no son ácido-alcohol resistentes aparecerán de color azul después de la aplicación del colorante de contraste.

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    Figure \(\PageIndex{1}\): Tinción de Ziehl-Neelsen (http://es.Wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen).