7: PCR de colonias de levadura

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Las cepas de S. cerevisiae que estamos utilizando este semestre fueron construidas por el Proyecto de Deleción Gene Saccharomyces. En el proyecto, los investigadores de levaduras reemplazaron sistemáticamente cada ORF del genoma de la levadura con un gen bacteriano de resistencia a la kanamicina (KAN ^R). En este laboratorio, utilizará la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificar los genes MET alterados en sus cepas de deleción. Las ADN polimerasas termoestables (arriba) juegan un papel clave en la PCR.

Objetivos

Al final de este laboratorio, los estudiantes deben ser capaces de:

describir las reacciones que están ocurriendo a las diferentes temperaturas utilizadas en los ciclos de PCR.
diseñar cebadores oligonucleotídicospara amplificar secuencias con PCR.
explicar cómo los cambios en la temperatura de recocido y el tiempo de extensión afectan la producción de productos de PCR.
diseñar y llevar a cabo una estrategia de PCR que distinga tres cepas de deleción met.

En un laboratorio anterior, utilizó diferentes medios de cultivo para distinguir entre diferentes mutantes de S. cerevisiae met. Tus resultados pueden haberte permitido identificar tentativamente tus cepas. En este laboratorio, utilizará la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificar de manera más concluyente las cepas mutantes. Este capítulo comienza con una visión general de la PCR y el Proyecto de Eliminación de Genes de Saccharomyces. Utilizarás estos conocimientos para diseñar y llevar a cabo una estrategia para identificar cepas de met deleción mediante PCR de colonias de levadura.