16.6: Micro-informe 5- SDS-PAGE y análisis Western blot

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En este reporte, describirás los resultados de la SDS-PAGE y las transferencias Western que utilizaste para analizar la expresión de proteínas en tus células transformadas bajo condiciones tanto reprimidas como inducidas. Prestar especial atención al grado en que estos resultados confirman o contradicen los resultados del anterior reporte de transformación/complementación. La figura debe etiquetarse de tal manera que un científico experimentado sea capaz de entender tus resultados solo a partir de la figura y la leyenda. Muchos detalles experimentales han sido relegados a la sección de M&M. Los carriles deben estar claramente etiquetados y se deben incluir los pesos moleculares de los patrones. (El siguiente ejemplo es de una clase diferente, donde los estudiantes utilizaron SDS-PAGE y transferencias Western para analizar la sobreexpresión de proteínas de levadura expresadas a partir de pBG1805. Tenga en cuenta que, a diferencia de sus experimentos, se utilizó un anticuerpo primario contra el epítopo HA para detectar proteínas en transferencias Western).

Materiales y Métodos: Proporcionar información sobre cepas transformadas, condiciones de incubación, preparación de extractos celulares, geles SDS-PAGE y transferencias Western. Referir los procedimientos publicados cuando sea posible, señalando cualquier modificación. Los subtítulos pueden ser útiles.

Cepas transformadas: Incluye los nombres de las cepas y plásmidos que utilizaste para preparar extractos celulares.

Extractos: Incluir información sobre los medios y tiempos de incubación utilizados para manipular la sobreexpresión de proteínas de las cepas. Haga referencia al manual para el procedimiento de extracción, anotando cualquier modificación.

Geles SDS-PAGE: Proporcionar detalles sobre el% de acrilamida de los geles, el tiempo de funcionamiento y el voltaje utilizados para la electroforesis.

Transferencia electroforética: Incluir el tiempo y voltaje utilizados para transferir proteínas del gel SDS-PAGE a la membrana PVDF. Consulte el manual para otros detalles.

Western blot: Incluye los anticuerpos que usaste para la transferencia y las condiciones (tiempo, temperatura) que usaste para cada una de las incubaciones. Incluya el tiempo que utilizó para detectar proteínas sobreexpresadas con TMB. (Esto da una cierta sensación de la abundancia de la proteína en sus extractos.) NO es necesario incluir todos los pasos de lavado, solo haga referencia al manual.

Resultados y Discusión - Comience por discutir el gel SDS-PAGE. El gel SDS-PAGE proporciona una instantánea de las proteínas celulares y una comparación aproximada de las concentraciones de proteínas en diferentes extractos. La intensidad de tinción de una banda refleja su abundancia en el extracto.

¿Cómo se comparó la cantidad total de proteína entre muestras inducidas y no inducidas? (¿Qué podría indicar esto sobre las diferentes fuentes de carbono?)
¿Viste algún cambio en bandas individuales en el gel? ¿Es posible detectar la proteína de fusión contra el fondo de otras proteínas en el extracto? Recordemos que las células tienen miles de proteínas y que una banda puede consistir en más de una especie proteica.
El western blot permite detectar la proteína de fusión contra el fondo de otras proteínas celulares. Incluir una tabla que muestre los tamaños predichos y reales de las proteínas Met o LacZ detectadas mediante la técnica de transferencia Western. Los tamaños de las proteínas son particularmente importantes. (Probablemente no sea posible obtener un valor exacto de los tamaños de proteína, debido a la fuzziness de los estándares en las transferencias western. Sin embargo, deberías poder colocar las proteínas dentro de un cierto rango.) Las proteínas codificadas por el plásmido serán más grandes que la proteína de origen natural debido a las etiquetas de epítopo codificadas por el plásmido. ¿Los tamaños observados son los que esperabas?

Otras preguntas a abordar en la Discusión:

¿Viste evidencia de inducción por el promotor GAL1 ya sea en el gel o en la mancha?
¿Cómo se relacionaron los resultados de Western blot con sus resultados de complementación? ¿Cómo estos resultados enriquecen o debilitan sus hallazgos de complementación?
Si no detectaste proteínas en tu mancha, proponte algunas explicaciones. Compara las muestras. ¿Las otras muestras proporcionan buenos controles positivos para su técnica?