1.1: El ADN como material genético

A principios del siglo XX muchas personas pensaban que la proteína debe ser el material genético responsable de las características heredadas. Una de las razones detrás de esta creencia fue el conocimiento de que las proteínas eran moléculas bastante complejas y por lo tanto, deben ser especificadas por moléculas de igual o mayor complejidad (es decir, otras proteínas). Se sabía que el ADN era una molécula relativamente simple, en comparación con las proteínas, y por lo tanto era difícil entender cómo una molécula compleja (una proteína) podía ser determinada por una molécula más simple (ADN). ¿Cuáles fueron los experimentos clave que identificaron al ADN como el material genético primario?

1928 F. Griffith

Antecedentes:

Diplococcus pneumoniae, o neumococo, es una pequeña bacteria desagradable que, cuando se inyecta en ratones, causará neumonía y muerte en el ratón. La bacteria contiene un polisacárido capsular en su superficie que protege a las bacterias de las defensas del huésped. Ocasionalmente, surgen variantes (mutantes) de las bacterias que tienen un defecto en la producción del polisacárido capsular. Los mutantes tienen dos características: 1) Son avirulentos, lo que significa que sin el polisacárido capsular adecuado son incapaces de montar una infección en el huésped (son destruidos por las defensas del huésped), y 2) Debido a la falta de polisacárido capsular la superficie del mutante aparece áspera bajo el microscopio y se puede distinguir de las bacterias de tipo silvestre (cuya superficie parece lisa).

Figura 1.1.1: Neumococo de tipo silvestre vs. Mutante

El neumococo virulento liso de tipo salvaje puede tratarse térmicamente y hacerse avirulento (sin embargo, todavía aparece suave bajo el microscopio). Finalmente, existen varios subtipos diferentes de polisacárido capsular de neumococo (subtipos I, II y III). Estos subtipos son fácilmente distinguibles entre sí, y cada uno puede dar lugar a mutantes que carecen de polisacárido capsular (es decir, el tipo rugoso avirulento).

Los experimentos:

Controles:

• w.t. (suave) + ratón = ratón muerto
• mutante (áspero) + ratón = ratón vivo
• tratamiento térmico w.t. (liso) + ratón = ratón vivo

Combinaciones:

• tratamiento térmico w.t. (liso) + mutante (áspero) + ratón = ratón muerto

En este caso, cuando las bacterias se recuperaron del ratón frío sin vida, fueron neumococos virulentos lisos (es decir, indistinguibles de tipo silvestre).

Una mirada más cercana a lo que está sucediendo, al seguir usando y haciendo un seguimiento de los diferentes subtipos

• tratamiento térmico w.t. (liso) tipo I + mutante (rugoso) tipo II + ratón = ratón muerto

En este caso cuando las bacterias se aislaron del ratón frío sin vida eran neumococos tipo I virulentos lisos.

Las conclusiones generales de estos experimentos fueron que había un “agente transformante” en la bacteria tipo I tratada térmicamente que transfomó la bacteria mutante viva (rugosa) tipo II para poder producir polisacárido de cápsula tipo I.

Pregunta

¿El “agente transformante” era proteína o ADN, o qué?

1944 O.T. Avery

Antecedentes:

El experimento de Griffith no pudo continuar hasta que se desarrollaron métodos para separar y purificar los componentes celulares de ADN y proteínas. Avery utilizó métodos para extraer ADN relativamente puro del neumococo para determinar si era el “agente transformante” observado en los experimentos de Griffith.

El experimento:

• w.t. (liso) tipo I -> extraer el componente de ADN
• mutante (rugoso) tipo II + ADN tipo I + ratón = ratón muerto

El aislamiento de bacterias del ratón muerto mostró que eran bacterias tipo I w.t. (lisas)

Un experimento más sofisticado:

El ADN tipo I purificado se dividió en dos alícuotas. Una alícuota se trató con DNasa, una enzima que degrada inespecíficamente el ADN. La otra alícuota se trató con Tripsina, una proteasa que degrada (relativamente) de manera no específica las proteínas.

• ADN tipo I + ADNasa + mutante (rugoso) tipo II + ratón = ratón vivo
• ADN tipo I + tripsina + mutante (rugoso) tipo II + ratón = ratón muerto

Conclusión:

El trabajo de Avery aportó pruebas contundentes de que el “agente transformante” era en realidad ADN (y no proteína). No obstante, no todos estaban convencidos. Algunas personas sintieron que una cantidad residual de proteína podría permanecer en el ADN purificado, incluso después del tratamiento con Tripsina, y podría ser el “agente transformante”.

1952 A.D. Hershey y M. Chase

Antecedentes:

T2 es un virus que ataca a la bacteria E. coli. El virus, o fago, parece un pequeño módulo de aterrizaje lunar:

Figura 1.1.2: Fago T2

Las partículas virales se adsorben a la superficie de las células de E. coli. Se sabía que algún material luego sale del fago y entra en la célula. Las partículas de fago “vacías” en las células de la superficie se pueden eliminar físicamente poniendo las células en una licuadora y batiéndolas. En cualquier caso, unos 20 minutos después de que el fago se adsorba a la superficie de la bacteria, la bacteria se abre (lisis) y libera una multitud de virus de la progenie.

Si los medios en los que crecieron las bacterias (y fueron infectadas) incluían ATP marcado con ³² P, el fago de la progenie podría recuperarse con este isótopo incorporado a su ADN (las proteínas normales contienen solo átomos de hidrógeno, nitrógeno, carbono, oxígeno y azufre). Asimismo, si el medio contenía metionina marcada con ³⁵ S, el fago de la progenie resultante podría recuperarse con este isótopo presente solo en sus componentes proteicos (el ADN normal contiene solo átomos de hidrógeno, nitrógeno, carbono, oxígeno y fósforo).

El experimento:

Los fagos se cultivaron en presencia de marcadores isotópicos ³² P o ³⁵ S.

1) E. coli se infectaron con fagos marcados con ³⁵ S. Después de la infección, pero antes de la lisis celular, las bacterias se batieron en una licuadora y las partículas de fago se separaron de las células bacterianas. Las células bacterianas aisladas se cultivaron adicionalmente hasta que se produjo la lisis. Se aislaron los fagos de la progenie liberada.

Donde fue la etiqueta ³⁵ S:

• Cáscaras de fago adsorbidas 85%
• Células infectadas (antes de la lisis) 15%
• Desechos celulares lisados 15%
• Fago de progenie < 1%

2) E. coli se infectaron con fagos marcados con ³² P. Se realizaron los mismos pasos que en 1) anterior.

Donde fue la etiqueta ³² P:

• Carcasas de fagos adsorbidos 30%
• Células infectadas (antes de la lisis) 70%
• Desechos celulares lisados 40%
• Progenie fago 30%

Conclusión:

El material que se estaba transfiriendo del fago a la bacteria durante la infección parecía ser principalmente ADN. Aunque los resultados no fueron del todo inequívocos, brindaron apoyo adicional a la opinión de que el ADN era el “material” de la herencia genética.