1.3: Sistema de restricción/modificación bacteriana

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El sistema de restricción/modificación en bacterias es un sistema inmune a pequeña escala para la protección contra la infección por ADN extraño.

W. Arber y S. Linn (1969)

Eficacias de siembra del bacteriófago lambda (l fago) cultivado en las cepas de E. coli C, K-12 y B, cuando se sembraron en placa sobre estas bacterias:

Cepa de E. coli en la que se habían cultivado fagos parentales		Cepa de E. coli para sembrar fagos
	C	K-12	B
C	1	<10 ^-4	<10 ^-4
K-12	1	1	<10 ^-4
B	1	<10 ^-4	1

Se encontró que el ADN del fago que había sido cultivado en las cepas K-12 y B tenía bases modificadas químicamente que estaban metiladas.
Estudios adicionales con otras cepas indican que diferentes cepas tenían bases metiladas específicas.
Los sitios típicos de metilación incluyen la posición N ₆ de la adenina, la posición N ₄ de la citosina o la posición C ₅ de la citosina.

Figura 1.3.1: Metilación

Además, solo un porcentaje fraccional de bases estaban metiladas (es decir, no todas las adeninas estaban metiladas, por ejemplo) y estas ocurrieron en sitios muy específicos en el ADN.
Un rasgo característico de los sitios de metilación, fue que involucraron secuencias de ADN palindrómico.

Captura de pantalla (191) .png

Figura 1.3.2: Especificidad de EcoR1 metilasa. Rubin y Modrich, 1977

Además de poseer una metilasa particular, las cepas bacterianas individuales también contenían actividades específicas de endonucleasa acompañantes.
Las endonucleasas se escindieron en o cerca del sitio de reconocimiento de metilación.

Captura de pantalla (193) .png

Figura 1.3.3: Escisión en sitios de metilación

Estas nucleasas específicas, sin embargo, no se escindirían en estas secuencias palindrómicas específicas si el ADN estuviera metilado.

Así, esta combinación de una metilasa y endonucleasa específicas funcionó como un tipo de sistema inmune para cepas bacterianas individuales, protegiéndolas de la infección por ADN extraño (por ejemplo, virus).

En la cepa bacteriana EcoR1, la secuencia GAATTC será metilada en la base adenina interna (por la metilasa EcoR1).
La endonucleasa EcoR1 dentro de la misma bacteria no escindirá el ADN metilado.
El ADN viral foráneo, que no está metilado en la secuencia “GAATTC”, será reconocido como ADN “extraño” y será escindido por la endonucleasa EcoR1.
La escisión del ADN viral lo hace no funcional.

“Dichas endonucleasas se denominan “" endonucleasas de restricción "” porque restringen el ADN dentro de la célula a ser “" auto "”.”

La combinación de endonucleasa de restricción y metilasa se denomina sistema de “restricción-modificación”.

Por supuesto, este tipo de sistema protector es batido si el fago atacante se cultivó previamente en la misma cepa que la que está infectando. En este caso el fago tendrá su ADN ya metilado en la secuencia apropiada, y será reconocido como “self” (ver la tabla anterior). La cepa 'C' de E. coli (arriba) es una cepa que no tiene un sistema conocido de restricción-modificación.

Discutiremos la replicación del ADN más adelante, pero cabe mencionar que:

el ADN hospedador replicante inicialmente tendrá una hebra (parental) metilada y la otra (cadena naciente) no metilada.
Esto es reconocido como “self” y no es escindido por la endonucleasa de restricción.
Posteriormente es metilado por la metilasa huésped.

Estudios estructurales y bioquímicos han indicado que para los sistemas R/M comunes (llamados tipo II), la metilasa reconoce y metila una hebra del dúplex de ADN, mientras que la endonucleasa de restricción reconoce ambas cadenas del ADN (es decir, ambas las hebras deben estar no metiladas para su reconocimiento). Es capaz de hacer esto porque es una proteína homo-dímera.

Endonucleasas de restricción

Dado que diferentes cepas y especies bacterianas tienen potencialmente diferentes sistemas R/M, su caracterización ha hecho disponibles más de 200 endonucleasas con diferentes sitios de escisión específicos de secuencia.

Son una de las principales herramientas de la biología molecular moderna para la manipulación e identificación de secuencias de ADN.
Las endonucleasas de restricción suelen denominarse así por la bacteria de la que se aisló.

Ejemplos de diferentes enzimas de restricción

Nombre	Fuente	Secuencia de reconocimiento	Comentarios
Alu I	Artrobacter luteus	\| 5'… A G C T … 3' 3'… T C G A … 5' \|	“Cuatro cortador”. Deja extremos romos al ADN.
Bfa I	Bacteroides fragilis	\| 5'… C T A G … 3' 3'… G A T C … 5' \|	“Cuatro cortador”. Hojas 5' voladizo.
Nci	Neisseria cinerea	\| C 5'… C C G G G … 3' 3'… G G C C C … 5' G \|	“Cinco cortador”. La base media puede ser citosina o guanina. Hojas 5' voladizo. Diferentes sitios de reconocimiento pueden tener secuencias no complementarias.
Eco R1	Escherichia coli	\| 5'… G A A T T C … 3' 3'… C T T A A G … 5' \|	“Seis cortador”. Hojas 5' voladizo. Se comporta como un “cuatro cortador” (actividad 'estrella') en búfer alto en sal. $44 por 10,000 unidades.
Hae II	Haemophilus aegyptius	\| 5'… Pu G C G C Py … 3' 3'… Py C G C G Pu … 5' \|	“Seis cortador”. Pu es cualquier purina, Py es cualquier pirimidina. Voladizo de las hojas 3'.
ECOO109i	Escherichia coli	\| 5'… Pu G G N C C Py … 3' 3'… Py C C N G G Pu … 5' \|	“Siete cortador”. Pu es cualquier purina, Py es cualquier pirimidina, N es cualquier base. Hojas 5' voladizo. Diferentes sitios de reconocimiento pueden tener secuencias no complementarias.
Bgl I	Bacillus globigii	\| 5'… GCCN NNNNGGC … 3' 3'… CGGNNNN NCCG … 5' \|	“Seis cortador con palíndromo interrumpido”. Hojas 5' voladizo. Diferentes sitios de reconocimiento pueden tener secuencias no complementarias.
Bsa HI	Bacillus stearothermophilus	\| 5'… G Pu C G Py C … 3' 3'… C Py G C Pu G … 5' \|	“Seis cortador”. Diferentes sitios de reconocimiento serán complementarios.
Aat II	Acetobacter aceti	\| 5'… G A C G T C … 3' 3'… C T G C A G … 5' \|	“Seis cortadoras” con voladizo de 3'. Misma secuencia de reconocimiento que Bsa HI, pero diferente posición de escisión.
Bpm I	Bacillus pumilus	\| 5'… C T G G A G N₁₆ … 3' 3'… G A C C T C N₁₄ … 5' \|	No palíndromo, escisión distal. Hojas 3' voladizo. $50 por 50 unidades.
No yo	Nocardia otitidiscaviarum	\| 5'… G C G G C C G C … 3' 3'… C G C C G G C G … 5' \|	“Ocho cortador”. Hojas 5' voladizo.
BSM I	Bacillus stearothermophilus	\| 5'… G A A T G C N … 3' 3'… C T T A C G N … 5' \|	“raro”. Voladizo de las hojas 3'.

La utilidad de las endonucleasas de restricción radica en su especificidad y la frecuencia con la que sus sitios de reconocimiento ocurren dentro de cualquier muestra de ADN dada.
Si hay una probabilidad del 25% para una base específica en cualquier sitio dado, entonces la frecuencia con la que se producirán diferentes sitios de endonucleasas de restricción se puede calcular fácilmente (0.25 ⁿ):

Especificidad de nucleótidos	Ejemplo	Frecuencia de ocurrencia
Cuatro	Alu I	256 (0.25 Kb)
Cinco	Nci	1024 (1.0 Kb)
Seis	EcoR I	4096 (4.1 Kb)
Seven	ECOO109i	16384 (16.4 Kb)
Ocho	No yo	65536 (65.5 Kb)

Así, en promedio, cualquier ADN dado contendrá un sitio Alu I cada 0.25 kilobases, mientras que un sitio Not I ocurre una vez aproximadamente cada 65.5 kilobases.

Not I es, por lo tanto, una enzima muy útil para aislar grandes regiones de ADN, típicamente en investigaciones que involucran manipulaciones de ADN genómico.
Se esperaría que Alu I digiriera una muestra de ADN en muchos trocitos pequeños.

El surtido de fragmentos de ADN representaría una “huella” específica del ADN particular que se está digiriendo. Diferentes ADN no producirían la misma colección de tamaños de fragmentos. Así, el ADN de diferentes fuentes puede emparejarse o distinguirse basándose en el ensamblaje de fragmentos después del tratamiento con endonucleasas de restricción. Estos se denominan “polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción”, o RFLP. Este simple análisis se utiliza en diversos aspectos de la biología molecular, así como una aplicación de la ley y genealogía. Por ejemplo, las variaciones genéticas que distinguen a los individuos también pueden dar como resultado menos sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción o adicionales.

“Las endonucleasas de restricción se suministran en diversas concentraciones con actividades que se basan en las tasas de escisión de muestras de ADN “" estándar "”.”

Una unidad de actividad se define típicamente como la cantidad de enzima requerida para digerir (o “restringir”) un microgramo de ADN de referencia en una hora a 37 °C.
El ADN de referencia puede tener realmente uno o más sitios de reconocimiento para la nucleasa en cuestión. “Los ADN utilizados como muestras “" estándar "” pueden incluir ADN del fago I, o el plásmido pBR322.”
La hidrólisis de la endonucleasa es una reacción espontánea y no requiere, por ejemplo, la adición de ATP. Los tampones de reacción para endonucleasas de restricción generalmente contienen un componente tampón (típicamente tampón TRIS 10 mM alrededor de pH 8,0), sal de magnesio (a menudo MgCl ₂ 10 mM), un agente reductor (generalmente ditiotreitol 1 mM, o DTT), una proteína portadora protectora (típicamente albúmina sérica bovina de 100 m l, o BSA), y sal (cloruro de sodio).
El mayor determinante de la actividad enzimática es típicamente la concentración iónica (contenido de NaCl) del tampón. Aunque existen cientos de diferentes endonucleasas de restricción, la mayoría de ellas pueden exhibir entre 30-100% de actividad utilizando un sistema simple de tres tampones, que contienen concentraciones bajas (20 mM), medias (100 mM) o altas (250 mM) de sal (NaCl) en el tampón descrito anteriormente.

Las digestiones enzimáticas se realizan normalmente durante 1-2 horas a 37 °C; sin embargo, la digestión cuantitativa a veces solo se puede lograr después de incubación prolongada (es decir, durante la noche).

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