1.6: Superbobinado de ADN y Topoisomerasas
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- Este superbobinado aumenta con la progresión de la bifurcación de replicación.
- Si no se alivia el superenrollamiento, impedirá físicamente el movimiento de la helicasa.
La topología del ADN puede describirse mediante tres parámetros:
- Número de vinculación (L) Un valor entero. “Positivo” se hace referencia como diestro.
- Twist (T) Un número real (el número de enlace “aparente”)
- Writhe (W) Un número real (“supercoils” en la estructura del ADN)
Considere ADN circular cerrado:
- El número de enlace es un valor entero.
- Se refiere al número de veces que los dos hilos del dúplex hacen un giro completo de 360 grados.
Para el ADN cerrado circularmente, como el genoma de E. coli, el número de enlace solo se puede cambiar si hacemos lo siguiente:
- romper físicamente el dúplex
- introducir (o quitar) un giro de 360 grados
- ligar (cerrar covalentemente) la ruptura.
.png)
Figura 1.6.1: Giros para cambiar el número de enlace
Experimento de “hélice” de tubos de caucho
Corte dos longitudes de tubería de caucho de 1/8", cada una de aproximadamente 20" de largo. Inserte un trozo más pequeño de tubo o punta de pipeta en los extremos para permitir que los extremos se conecten. Estas dos piezas de tubo de goma representan cada hebra de un dúplex de ADN. El ADN puede ligarse, o unirse, cuando tenemos extremos 5' (fosfato) y 3' (hidroxilo). Entonces necesitamos una manera de hacer un seguimiento de qué extremo es cuál para cada pieza de tubería.
- Puedes escribir “5" y “3" en los extremos opuestos de cada pieza y alinearlos en direcciones opuestas, o
- En una pieza de tubería, marque ambos extremos con un sharpie. Solo se pueden ligar extremos de colores similares (ver diagrama anterior)
Esto le permitirá mantener la “orientación” correcta de la hebra cuando “ligue” las hebras del dúplex.
- Introducir un número de enlace = +2 (dos giros de 360° para diestros en el dúplex)
- luego “ligar” los extremos (asegúrate de mantener la orientación de la hebra, es decir, conectas los dos hilos apropiados).
Confirmar que se ha introducido el número de enlace correcto “fundiendo” el dúplex en un lado y forzando todos los giros en una pequeña región del dúplex (fácil de contar de esta manera).
- Confirma que mirando hacia abajo la hélice a las vueltas que son “diestros” (no importa de qué manera mires hacia abajo la hélice).
Tenga en cuenta que el “dúplex” cuando se sostiene entre el pulgar y el índice y se le permite colgar, prefiere una topología “superenrollada”, a diferencia de “relajada” [Nota: esto generalmente se ve con tubos muy flacos, los tubos de mayor diámetro pueden no adoptar fácilmente esta topología].
- Confirma que las “superbobinas” son realmente zurdas mientras miras hacia abajo las superbobinas (independientemente de la dirección hacia abajo de las superbobinas).
- La “superbobina” es muy probablemente un 360° completo, en lugar de 180°. En cualquier caso, sostenga los extremos del dúplex para que esté presente una “superbobina” de 360° zurda.
- Ahora, cuente cuántas veces los hilos del “dúplex” se cruzan entre sí. En esta conformación, las hebras del “dúplex” en realidad no se cruzarán entre sí (Nota: puede tener un cruce de hebra y luego descruzarlo, para un resultado neto de no cruce).
Por lo tanto, en respuesta a la introducción del número de enlace +2, el “dúplex” puede adoptar +2 (180°) “superbobinas”, de manera que el número de enlace aparente resultante (es decir, el valor de "torsión"”) de las dos hebras es cero
Nota
Una superbobina se considera positiva, si es “zurda”).
- Retire una superbobina "positiva" desenrollando 180°.
- Ahora sostenga los extremos del “dúplex” y cuente el número aparente de enlace (es decir, "giros “). Habrá un solo "giro” diestro.
- Por lo tanto, una única superbobina “positiva” de 180° tiene el efecto de eliminar una sola torsión “positiva” (es decir, reduce el número aparente de varillaje en 1).
El número Writhe se refiere al número de superbobinas presentes.
- Aunque pueda parecer que la consecuencia de introducir superenrollamiento (Writhe) es cambiar el número de Linking, no lo es.
- La consecuencia de Writhe es que el Twist (número aparente de enlace) se altera (aumenta o disminuye).
“El ADN tiene un valor de “" Twist "” preferido (número de enlace aparente preferido) para una longitud especificada de ADN:”
- El modelo de Watson y Crick del dúplex de ADN tenía 10 pares de bases por turno.
- Bajo condiciones fisiológicas de sal (0,15 M NaCl) y temperatura, el ADN prefiere adoptar alrededor de 10.6 bp/giro.
- Writhe se introduce en el ADN para lograr este valor para el “Twist” (número aparente de enlace)
Para un número de enlace dado (fijo) sobre una longitud dada de ADN, el ADN puede adoptar superbobinas positivas o negativas para lograr una “torsión” (número de enlace aparente) tal que habrá 10.6 pares de bases/giro.
El número de enlace no cambia con el superbobinado (solo puede cambiar rompiendo el dúplex)
- Writhe tiene el efecto de cambiar el número aparente de Vinculación.
- Una superbobina se define como ser capaz de cambiar el número aparente de enlace en +/- 1.
El valor de torsión (número de enlace aparente) para una longitud dada de ADN está relacionado con el número de pares de bases por giro que el ADN quiere adoptar:
Número de Vinculación = (tamaño del ADN en pares de bases)/(líneas bases/giro) + Writhe
o
Número de varillaje = #of Giros + Writhe
esto generalmente se abrevia como
Varillaje = Twist + Writhe
L = T + W
Por ejemplo, si tenemos una molécula de ADN circularmente cerrada con una longitud de 5300 pares de bases, y una conformación preferida de 10.6 pares de bases por turno, ¿puede lograr esta conformación sin tener que introducir ningún superenrollamiento (es decir, retorcerse)?
Número aparente de varillaje (Twist) = (5300 pares de bases)/(10.6 pares de bases/giro)
Número de enlace aparente (Twist) = 500
Es decir, para lograr la conformación deseada de 10.6 bp/vuelta en la hélice, se requieren exactamente 500 vueltas sobre la longitud de 5300 pares de bases.
Número de enlace = 500 + Writhe
Podemos tener valores integrales para el número de enlace, y ciertamente podemos introducir 500, lo que no requeriría ninguna escritura en absoluto:
500 = 500 + 0
¿Cuál es la molécula de ADN era 5200 pares de bases?
Número aparente de varillaje (Twist) = (5200 pares de bases)/(10.6 pares de bases/giro)
Número de enlace aparente (Twist) = 490.6
Podemos introducir ya sea 490 o 491 como número de enlace, pero no 490.6. ¿Qué sucede si hay un número de enlace de 490 en la molécula de ADN?
Número de enlace = Twist + Writhe
490 = 490.6 + Writhe
Escritura= -0.6
En este caso, el ADN adopta una superbobina negativa de 0.6 (aproximadamente 108° de una superbobina diestra) que incrementará el número aparente de enlaces de 490 a 490.6 (y alcanzará 10.6 pares de bases por giro en el dúplex).
¿Cuántos pares de bases por turno habría en el ADN si el ADN no pudiera adoptar ninguna estructura de superbobina para esta longitud de ADN con un número de enlace de 490?
Número de enlace = Twist + Writhe
490 = Torsión + 0
Torsión = 490 vueltas
Torsión = (5200 pares de bases)/(bp/giro) = 490 vueltas
bp/giro = 5200 pares bases/490 giros
bp/giro = 10.61
Hay un poco más de 10.6 pares de bases por turno en el ADN
Un pequeño genoma cerrado circularmente
El genoma del virus de los simios 40 (SV40) es un genoma de ADN circular, cerrado y bicatenario. Para los efectos de esta discusión, cuenta con 5300 bases. Se espera que en condiciones fisiológicas el ADN exhiba 10.6 pares de bases por giro (es decir, un Twist = 10.6 bp/giro). En este caso, sin Writhe, el número de Vinculación sería:
Número de enlace = 5300 bp/ (10.6 bp/giro) + 0
Número de vinculación = 500 vueltas
es decir, esperaríamos 500 giros de 360° de las cadenas de ADN a lo largo del genoma circular.
- Esta forma (con 10.6 pares de bases por giro) sin Writhe representa la hélice de ADN “estándar” o no distorsionada.
- Esto también se conoce como la forma “relajada” de ADN, y el dúplex se podría colocar físicamente plano sobre una superficie porque no necesita Writhe para lograr el valor preferido de 10.6 pares de bases por torsión:
.png)
Figura 1.6.2: Hélice de ADN estándar
Sin embargo, cuando se completa inicialmente la replicación de SV40 se observa que queda una región dúplex abierta en el ADN:
.png)
Figura 1.6.3: ADN con región abierta
El resultado es que hay alrededor de 475 vueltas de la hélice dentro del ADN dúplex (es decir, el número de Enlazamiento = 475).
- Se dice que el ADN está socavado.
- Un área abierta es energéticamente desfavorable.
- La molécula cerrada covalentemente no puede ajustarse para esto aumentando el número de Enlazamiento. Es decir, no puede romper espontáneamente una o ambas hebras del dúplex, introducir otras 25 vueltas en el dúplex (aumentar el número de Vinculación en 25) y volver a ligar el dúplex.
El ADN tiene tres opciones:
- Puede ajustar el número de pares de bases por giro a lo largo de la molécula de 10.6 bp/giro deseado a 11.2 bp/giro (es decir, 5300 bp/475 vueltas). (NOTA: un aumento en el número de pares de bases por turno disminuirá el valor de torsión; el ADN subenrollado tiene un mayor número de pares de bases por turno).
- El ADN puede enrollarse en una topología de “superbobina” y mantener el valor de torsión deseado (10.6) con el número de enlace dado (475 en este caso).
- El dúplex puede existir con una torsión de 10.6 bp/vuelta para la mayor parte de la estructura, y luego tener una región con torsión cero (no necesariamente un dúplex fundido). Esto es bastante desfavorable debido a la geometría requerida de los ángulos de unión.
Así, para el genoma SV40 de 5300 pb, con un número de Vinculación de 475, para mantener un valor de 10.6 bp/twist, se necesitan un total de 25 superbobinas negativas (Escritura=25):
475 = (5300/10.6) + Writhe
-25 = Writhe
- Es decir, 25 supercoils negativos (veinticinco giros de 180° del dúplex de ADN, diestros mientras miras hacia abajo el superenrollamiento).
Topoisomerasas
Las enzimas que controlan la topología del ADN son críticas para la replicación y transcripción del ADN.
- A medida que la horquilla de replicación se abre, la región del dúplex frente a la horquilla se sobreenrolla, es decir, tiene menos pares de bases por turno.
- El número de enlace no ha cambiado, pero la longitud del ADN que contiene todos los giros es efectivamente más corta.
- Para mantener 10.6 bp/giro en esa región, el ADN adoptará superbobinas positivas.
Por ejemplo, durante las primeras etapas de replicación de SV40, el dúplex alrededor del origen de replicación puede fundir (abrir) inicialmente una región de 750 bases. Dado que el número de enlace (500) no ha cambiado, se distribuye efectivamente solo sobre:
5300 - 750 = 4550 bases.
Suponiendo que no se ha introducido ningún superbobinado:
500 = 4550 pares de bases/(X bases /giro) + 0
= 9.1 bases por torsión
Así, si no se introduce superenrollamiento, el ADN debe adoptar una conformación de 9.01 pares de bases/torsión de la hélice dentro de la región por delante de la horquilla de replicación.
- Esto es energéticamente desfavorable, y una opción para el ADN es adoptar una configuración superenrollada para lograr 10.6 bp/twist:
500 = (4550/10.6) + Writhe
70.8 = Redactar
- Así, el movimiento de la horquilla creciente hace que el ADN adopte superbobinas positivas.
- En este caso el ADN ha adoptado 70.8 supercoils zurdos (180° cada uno).
- Twist (=pares de bases * [twist/baseair]) y Writhe son números reales.
Topoisomerasa Tipo I
- Las topoisomerasas tipo I cortan una hebra del ADN (es decir, “mella” el dúplex de ADN).
- El fosfato 5' de la cadena cortada se une covalentemente a una tirosina en la proteína.
- El extremo 3' de la mella pasa una vez a través del dúplex.
- Luego se vuelve a sellar el nick, y el número de enlace se cambia por un valor de +1.
- Por lo tanto, esto puede resultar en la eliminación de una única superbobina negativa.
En E. coli, la topoisomerasa tipo I solo puede aliviar el ADN superenrollado negativamente (el superenrollamiento negativo es el resultado final del genoma de ADN recién replicado). En eucariotas, la topoisomerasa tipo I también puede aliviar positivamente el ADN superenrollado.
El resultado neto de E. coli TopoI se puede esquematizar de la siguiente manera:
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Figura 1.6.4: E. coli Topoisomerasa I
Topoisomerasas Tipo II
- Las topoisomerasas tipo II realmente escinden el ADN dúplex al cambiar el número de enlaces.
- Las topoisomerasas tipo II pueden convertir una única superbobina positiva en una superbobina negativa.
- Así, el número de enlace se reduce en dos (-2) en un solo paso.
- Las topoisomerasas tipo II están involucradas tanto en la descatenación de cromosomas hijos como en el alivio del superenrollamiento positivo antes de la horquilla de replicación.
- La ADN girasa de E. coli es un ejemplo de topoisomerasa tipo II.
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Figura 1.6.5: Actividad de isomerasa Tipo II