3.2: Análisis de Secuencia de ADN

La secuenciación del ADN se logra con mayor frecuencia usando un procedimiento al que se hace referencia con uno de los siguientes nombres:

1. Secuenciación de Sanger
2. Secuenciación di-desoxiada
3. Secuenciación de terminaciones

• Cada uno de estos se refiere al mismo método:
  • el uso de la incorporación de didesoxibase en una reacción de polimerización
  • conduce a la terminación de la extensión de la imprimación (un método pionero por Fred Sanger, ahora retirado y felizmente dando por ahí en su jardín).

El método básico implica:

1. hibridar un cebador 5' a una región de ADN que nos gustaría secuenciar.
2. El cebador se extiende de la manera tradicional (es decir, con ADN polimerasa y los cuatro dNTP).
3. Sin embargo, se incluye una pequeña concentración de bases di-desoxídicas en la mezcla de reacción.
   • Por lo general, esto se logra teniendo cuatro reacciones separadas, en las que se agrega uno de los ddNTP.
   • Así, un tubo contendría cebador, molde, ADN polimerasa, los cuatro dNTP y ddATP, otro tubo tendría lo mismo pero con ddTTP en lugar de ddATP, y así sucesivamente para ddCTP y ddGTP.
4. Durante la reacción, los dNTP normales se incorporan a la cadena de crecimiento.
   • Sin embargo, ocasionalmente el ADN pol incorporará una base dd en el cebador en crecimiento.
   • Cuando esto sucede, el cebador no puede extenderse más (porque la base 3' dd no tiene un grupo hidroxilo 3' disponible).
   • El fragmento de ADN resultante comienza en el extremo 5' del cebador de secuenciación y termina en el sitio de incorporación de la base dd.

Así, en la mezcla de reacción que contiene la base dd ddATP, se obtendrá un conjunto de fragmentos de longitudes variables, cada uno terminando con la base ddA (es decir, en todas las posiciones en el molde donde había una base 'T' complementaria).

La mezcla que contiene ddCTP tendrá una mezcla diferente de fragmentos - contendrán ddC en los extremos 3' (en las posiciones en la plantilla donde se ubicaron las bases 'G').

Figura 3.2.1: Fragmentos de ADN

• Si los fragmentos de la mezcla de reacción 'A' se ejecutan en un gel de urea/acrilamida (típicamente 6%), los fragmentos se separarán según el tamaño.
• De igual manera para los fragmentos de mezcla de reacción 'C', 'G' y 'T'.
  • Si las cuatro mezclas de reacción diferentes se ejecutan una al lado de la otra, los tamaños de los fragmentos se pueden comparar directamente entre sí.
  • Obsérvese que el fragmento más corto esperado es el propio cebador y cuanto más largo es el fragmento, más lejos del cebador fue la reacción de extensión antes de la terminación.
• Considera un caso en el que la plantilla tenga un tramo de seis bases 'A' seguidas.
  • En la mezcla de reacción 'T' obtendremos posteriormente seis fragmentos; cada uno termina en 'T' y que difiere en una longitud de base.
  • Ninguna de las otras mezclas de reacción contendrá fragmentos entre estas longitudes (serán más largas o más cortas) porque ninguna de las otras mezclas de reacción terminará dentro de esta región.
  • Así, si ejecutamos las cuatro mezclas de reacción una al lado de la otra y observamos los patrones de fragmentos veríamos lo siguiente:

Figura 3.2.2: Patrones de fragmentos de ejemplo con 6 A

Ahora considere un molde que contenga la secuencia 3' GATC 5' (tenga en cuenta la orientación).

• Cuando el cebador se extiende en las diferentes mezclas de reacción se puede truncar primero en la G (incorporando una dd 'C'), luego en la A (incorporando una dd 'T') y así sucesivamente.
• Los fragmentos que se ejecutan en un gel se verían así:

Figura 3.2.3: Patrones de fragmentos de ejemplo con GATC

• Así, seguir la escalera de fragmentos en el gel de secuenciación permite “leer” la secuencia de la plantilla.
• Obsérvese sin embargo, que con respecto a la plantilla cuando leemos desde la parte inferior del gel hasta la parte superior estamos leyendo en la dirección 3' a 5' y leyendo las bases complementarias a la secuencia real.

Visualización de fragmentos

• Si dATP radiomarcado se agrega a las mezclas, se incorporará como una base de dATP “normal”.
  • Sin embargo, el fragmento de ADN resultante será radiomarcado.
  • Así, el gel de acrilamida puede exponerse a película de rayos X y determinar la ubicación de los fragmentos.
• Recientemente, los secuenciadores automatizados han hecho uso de tintes específicos que se etiquetan a las bases didesoxídicas.
  • Estos colorantes pueden ser “leídos” por un láser y así se puede identificar la base dd de terminación específica para un fragmento de ADN particular.
  • Así, los fragmentos pueden leer a medida que eluyen, en lugar de detener el gel y exponerlo.
  • Además, dado que cada base dd puede identificarse de manera única, las cuatro reacciones (ddA, ddC, ddG y ddT terminación de la cadena) se pueden realizar en un solo tubo y ejecutarse en un solo carril en un gel de secuenciación
    • Por lo tanto, los secuenciadores automatizados pueden leer más que con métodos manuales.
    • Dado que se usa un solo carril por muestra (en comparación con cuatro carriles con el método radiomarcado) se pueden analizar muchas más muestras y el rendimiento es mayor
• Los geles de acrilamida utilizados para el análisis de secuencias son típicamente de 50 cm a 100 cm de largo.
  • En la secuenciación manual se cargan las cuatro mezclas de reacción y el gel se ejecuta durante aproximadamente 2 horas después las muestras se recargan en otra parte del gel y se continúa el ciclo del gel. Un tercer conjunto de muestras se puede cargar después de otras 2 horas.
    • El gel se detiene después de que el frente de tinte de la última muestra cargada acaba de llegar al fondo del gel.
    • Así, los fragmentos cortos se pueden visualizar en la última carga, los fragmentos medios en la segunda carga y los fragmentos largos se visualizarán en el primer conjunto de mezclas de reacción cargadas.
    • La secuenciación manual puede resolverse en el orden de 400 bases de secuencia continua. Los secuenciadores automatizados pueden proporcionar rutinariamente el doble de esta cantidad de información.
  • Los secuenciadores automatizados utilizan los mismos tipos de placas de vidrio
    • El funcionamiento continuo del gel (y la identificación del tinte) significa que normalmente se pueden leer 400-700 bases o más
    • El software automático interpretará las señales de tinte en una secuencia
    • matices de la química de secuenciación y conocimiento experto se pueden programar en el software de análisis de secuencias (por ejemplo, el software puede compensar la “sonrisa” del gel)