4.2: Fago M13

El bacteriófago conocido como “M13" forma la base de sistemas de clonación diseñados para introducir fácilmente mutaciones en genes insertados en el genoma del fago. También se ha utilizado en diversas metodologías de “presentación de fagos” y bibliotecas “combinatorias” de ADN y péptidos.

Infección y replicación de M13

M13 es un bacteriófago filamentoso que infecta al huésped E. coli. El genoma M13 tiene las siguientes características:

• ADN circular monocatenario
• 6400 pares de bases de largo
• El genoma codifica para un total de 10 genes (nombrados usando números romanos I a X)

Figura 4.2.1: Genoma M13

• El gen VIII codifica para la proteína estructural principal de las partículas de bacteriófagos
• Códigos del gen III para la proteína menor de la cubierta

Figura 4.2.2: Gen III y Gen VIII

• La proteína del gen VIII forma una matriz tubular de aproximadamente 2.700 subunidades idénticas que rodean el genoma viral
• Aproximadamente de cinco a ocho copias de la proteína del gen III se localizan en los extremos del fago filamentoso (es decir, genoma más ensamblaje del gen VIII)
• Permite la unión al pilus bacteriano “sexual”
  • El pilus es una estructura superficial bacteriana de E. coli que alberga el elemento extracromosómico “factor F”

Infección

• El genoma monocatenario (cadena designada '+') unido al pilus entra en la célula huésped
  • Proteína principal de la cubierta (gen VIII) despojada
  • La proteína menor de la cubierta (gen III) permanece unida
• Los componentes del huésped convierten el genoma monocatenario (+) en ADN circular bicatenario (llamado la forma replicativa o “RF”)
• Comienza la transcripción
  • Serie de promotores
    • Proporciona un gradiente de transcripción tal que el gen más cercano a los dos terminadores de la transcripción se transcriben más
  • Dos terminadores
    • Uno al final del gen VIII
    • Uno al final del gen IV
  • La transcripción de los 10 genes procede en la misma dirección

Amplificación del genoma viral

• La proteína del gen II introduce 'nick' en la cadena (+)
• Pol I extiende la hebra (+) usando desplazamiento de hebra (y la hebra '-' como plantilla)
• Después de un viaje alrededor del genoma, la proteína del gen II vuelve a mellarse para liberar un genoma '+' completo (lineal)
  • Genoma lineal (+) circularizado
• Durante los primeros 15-20 minutos de replicación del ADN, las cadenas de la progenie (+) se convierten en forma bicatenaria (RF)
  • Estos sirven como plantillas adicionales para una transcripción adicional
• La proteína del gen V se acumula
  • Esta es una proteína de unión a ADN monocatenaria
  • Evita la conversión de una sola (+) hebra a la forma de RF
• Ahora obtenga una acumulación de ADN circular monocatenario (+) (genoma M13)

Figura 4.2.3: Amplificación del genoma

Envasado de fagos

• Proteína principal de la cubierta (Gen VIII) presente en la membrana de E. coli
• El genoma M13 (+), cubierto en la proteína de unión a ss - proteína del gen V, se mueve a la membrana celular
• La proteína del gen V se elimina y la proteína principal de la cubierta (Gen VIII) cubre el ADN del fago a medida que se extruye
  • Por lo tanto, el proceso de empaquetamiento no está vinculado a ninguna restricción de tamaño del genoma M13
  • La longitud del fago filamentoso se determina por el tamaño del ADN en el genoma
  • Insertos de hasta 42 Kb han sido introducidos en el genoma M13 y empaquetados (7x tamaño del genoma)
• Se adjuntan ~8 copias de la proteína Gene III al final del genoma extruido

Desarrollo de M13 en un vector de clonación

M13 se desarrolló en un vector de clonación útil insertando los siguientes elementos en el genoma:

• un gen para la proteína represora lac (lac I) para permitir la regulación del promotor lac
• la región operador-proximal del gen lac Z (para permitir la complementación a en un huésped con deleción proximal al operador del gen lac Z).
• un promotor lac aguas arriba del gen lac Z
• una región polienlazadora (sitio de clonación múltiple) insertó varios codones en el gen lacZ

Figura 4.2.4: Inserciones en el genoma

• Los vectores fueron nombrados de acuerdo a la región específica de polyliner que contenían
• Los vectores se construyeron típicamente en pares, con las regiones poliligadoras en orientaciones opuestas

Figura 4.2.5: Regiones de poliligador P

Clonación en vectores M13mp

• La forma RF (bicatenaria) del fago M13 puede aislarse y tratarse igual que cualquier otro plásmido
• “La región policonectora se puede “" abrir "” usando endonucleasas de restricción apropiadas para aceptar el fragmento de interés.”
• El fragmento se liga en la región plink
• La disponibilidad de plink de orientación inversa (por ejemplo mp18, mp19) significa que los fragmentos insertados con extremos no complementarios pueden insertarse en cualquier orientación

Formas monocatenarias del fago

La capacidad de aislar una forma monocatenaria del fago tiene ventajas tanto en la secuenciación como en la mutagénesis.

• El molde de ADN monocatenario se puede leer más que el molde bicatenario

Se desarrolló un método eficiente de mutagénesis (el método “Kunkel”) utilizando la forma monocatenaria del fago.

• El vector M13mp con inserto se cultiva primero en un hospedador E. coli mutante (por ejemplo CJ236) que ocasionalmente incorporaría uracilo en el ADN en lugar de timidina.
  • E. coli normalmente sintetiza una enzima (uracil-N-glicosidasa) que elimina los residuos de uracilo en el ADN. Sin embargo, en cepas ung-, el uracilo no se elimina
  • El nivel de mala incorporación de uracilo en el ADN se potencia en cepas que tienen una deficiencia en DUTPasa. Esta enzima convierte dUTP en dUDP, y por lo tanto, en las cepas dut- los niveles de dUTP son elevados y potencian la incorporación errónea de dUTP en el ADN del huésped
  • La cepa de E. coli CJ236 tiene un genotipo que incluye características dut-/ung-
• Un cebador mutagénico se hibridaría con este molde monocatenario (por ejemplo, para producir una mutación puntual)
• El cebador se extiende usando los cuatro dNTP, y se liga para producir ADN dúplex
• El ADN dúplex se inserta en una E. coli hospedadora diferente (por ejemplo, JM101) que reconoce y escinde (degrada) ADN que contiene uracilo (es decir, una cepa que es ung+)
• La cadena parental (de tipo salvaje) se degrada preferentemente y la cadena mutagénica se replica.
• La progenie de fagos típicamente tiene una alta incidencia (80-90%) de la mutación deseada.

Figura 4.2.6: Método Kunkel