8: Analizando ADN

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8.1: Introducción
La agarosa es un polímero de carbohidrato lineal purificado de las paredes celulares de ciertas especies de algas. El agar es una combinación del extracto crudo que contiene agarosa y el polisacárido más pequeño agaropectina. Cuando se disuelven y funden en líquido, las hebras de agarosa se enredan para formar una red que retiene el fluido en un gel. La reducción del fluido crea un mayor porcentaje del gel que es más firme y contiene poros más pequeños dentro de la red.
8.2: Replicación de ADN
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es un método para amplificar o copiar rápidamente una región de ADN en un tubo. Como su nombre lo indica, la técnica utiliza una enzima ADN polimerasa termoestable para imitar en un tubo lo que sucede dentro de una célula durante la replicación del ADN. La reacción en cadena nos permite copiar rápidamente el ADN de material fuente muy diminuto de manera exponencial. Esta técnica se utiliza en la ciencia forense, pruebas genéticas y clonación de genes raros.
8.3: Número Variable de repeticiones en tándem
La diferencia en las secuencias de nucleótidos entre humanos se encuentra entre 0.1-0.4%. Esto significa que las personas son más del 99% similares. Pero cuando miras a tus compañeros de clase por la habitación, puedes ver que esa pequeña diferencia equivale a bastante variación dentro de nuestra especie. La mayor parte de estas diferencias ni siquiera están dentro de las secuencias codificantes de los genes, sino que se encuentran afuera en regiones reguladoras que cambian la expresión de esos genes.
8.4: Propagación de ADN en bacterias
8.5: Enzimas de restricción
El ADN puede cortarse mediante endonucleasas de restricción (RE). Las endonucleasas son enzimas que pueden hidrolizar el polímero de ácido nucleico rompiendo el enlace fosfodiéster entre el fosfato y la pentosa en la cadena principal del ácido nucleico. Los biólogos moleculares también tienden a utilizar estas tijeras moleculares especiales que reconocen palíndromes de 6 u 8. Al usar 6 cortadores u 8 cortadores, las secuencias ocurren a lo largo de grandes tramos raramente, pero a menudo lo suficientemente como para ser de utilidad.
8.6: Huellas de ADN (RFLP)
El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es una técnica que explota variaciones en las secuencias de ADN. El ADN de diferentes fuentes tendrá variaciones o polimorfismos a lo largo de la secuencia. Usando Enzimas de Restricción, estas diferencias en las secuencias pueden ser burladas. Sin embargo, si se tomara la totalidad del genoma humano y se cortara con una enzima de restricción, se harían muchos fragmentos indescifrables.
8.7: Extracción de ADN de células de mejilla
Esta página contiene instrucciones sobre cómo extraer las células de las mejillas usando un citocepillo así como cómo usar las perlas de PCR.
8.8: D1S80 VNTR (Genotipado)
El marcador de minisatélites D1S80 se encuentra en 1p35-p36. Este VNTR tiene 16 bases de largo. Con una variación de alelos entre 3-24 repeticiones, el locus muestra suficiente diversidad para ayudar a distinguir entre las personas. Aunque este no es un marcador CoDiS, se requiere el uso de múltiples loci para identificar definitivamente las muestras. La repetición grande (16 pb) permite el uso de electroforesis en gel de agarosa estándar para explorar la diversidad de este locus en nuestro laboratorio. Los productos de PCR varían de 430bp a 814bp de largo.
8.9: Miniprep de ADN por Lisis Alcalina (Actividad)
Una vez que el ADN es introducido y transportado en bacterias, nos gustaría aislar el ADN nuevamente para su posterior manipulación. Para ello, las bacterias que contienen el plásmido de interés se cultivan en un cultivo líquido de caldo rico en nutrientes hecho de extracto de levadura llamado Caldo Luria-Bertani (LB). Estas bacterias cultivadas se cultivan hasta que tienen una alta concentración durante la noche. El sedimento resultante de bacterias se resuspende en un tampón fisiológico que contiene el quelante EDTA.
8.10: Secuenciación de ADN de Sanger
La polimerización de ácidos nucleicos ocurre en una dirección 5' → 3'. La posición 5' tiene un grupo fosfato mientras que la posición 3' de la hexosa tiene un grupo hidroxilo. La polimerización depende de estos 2 grupos funcionales para que se produzca una reacción de síntesis de deshidratación y extender la cadena principal de azúcar-fosfato del ácido nucleico. En la década de 1970, el grupo de Fred Sanger descubrió un método fundamentalmente nuevo de 'leer' la secuencia lineal de ADN usando bases especiales llamadas terminadores de cadena.
8.11: Secuenciación de Próxima Generación
La secuenciación tradicional de genomas fue un proceso largo y tedioso que clonó fragmentos de ADN genómico en plásmidos para generar una biblioteca de ADN genómico (ADNg). Estos plásmidos se secuenciaron individualmente utilizando la metodología de secuenciación de Sanger y se realizó computacional para identificar piezas superpuestas, como un rompecabezas. A medida que la tecnología mejoraba, el costo de secuenciar genomas se hizo menos costoso. Esta tecnología superó a la Ley de Moore, lo que resultó en una dramática disminución de los precios.