8.2: Replicación de ADN
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Francis Crick propuso 3 modelos de cómo el ADN podría replicarse. Crédito: Jeremy Seto (CC-BY 3.0)
Experimento Meselson y Stahl
Meselson & Stahl revelaron replicación semi-conservadora como método mediante el uso de ADN radiomarcado en bacterias. Crédito: Jeremy Seto (CC0)
Maquinaria de Replicación
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es un método para amplificar o copiar rápidamente una región de ADN en un tubo. Como su nombre lo indica, la técnica utiliza una enzima ADN polimerasa termoestable para imitar en un tubo lo que sucede dentro de una célula durante la replicación del ADN. La reacción en cadena nos permite copiar rápidamente el ADN de material fuente muy diminuto de manera exponencial. Esta técnica se utiliza en la ciencia forense, pruebas genéticas y clonación de genes raros. Debido al proceso de copia exponencial, una célula perdida que queda atrás puede proporcionar suficiente material genético para hacer miles de millones de copias de este ADN. El proceso de PCR se puede observar en una animación que se encuentra en el sitio web del Centro de Aprendizaje de ADN del Laboratorio Cold Spring Harbor
(http://www.dnalc.org/resources/3d/19-polymerase-chain-reaction.html).
Los cebadores son complementarios inversos a una de las 2 cadenas de ADN. Flanquean el área de interés y se incorporan al producto replicado. Crédito: Jeremy Seto (CC-BY 3.0)
Al igual que con cualquier proceso de replicación de ADN, uno necesita comenzar con una plantilla. La plantilla es el material de origen que está destinado a la duplicación. En este proceso, los científicos no están interesados en copiar la totalidad del genoma, solo un pequeño segmento de interés. Las ADN polimerasas requieren cebadores para iniciar el proceso de polimerización. Los cebadores se diseñan como pequeños segmentos de oligonucleótidos que flanquean el área de interés. Se trata de cadenas cortas de ADN que revierten el complemento al área de ADN de interés para que la ADN polimerasa tenga un punto de partida y se guíe únicamente al segmento de ADN de interés. Estos cebadores tienden a tener una longitud aproximada de 18-24 bases.
Sin embargo, una molécula de ADN bicatenario ya está emparejada por bases en una doble hélice por lo que nuestros cebadores no pueden interactuar. El primer paso de la PCR es separar la molécula de ADN bicatenario desnaturalizando los enlaces H usando calor alto (95°C). Las concentraciones de cebador son mucho más altas que la plantilla original. El siguiente paso de la PCR se llama recocido. Durante esta etapa, la temperatura se reduce a una temperatura de aproximadamente 55°C, esta temperatura sigue siendo caliente según nuestros estándares, pero es necesaria para mejorar la rigurosidad del emparejamiento correcto de bases de los cebadores con sus dianas en el molde. La ADN Polimerasa utilizada en este proceso se deriva de una bacteria que vive en temperaturas muy altas y no se desnaturaliza como lo harían otras proteínas en tales condiciones (termoestables). La enzima original se aisló de un organismo llamado Thermus aquaticus, por lo que llamamos a la enzima Taq polimerasa o simplemente Taq para abreviar. Esta bacteria vive en aguas termales donde las temperaturas son de aproximadamente 50°C pero prospera en un rango entre 50-80°C. La temperatura se eleva nuevamente a una temperatura más alta de 72°C para que la polimerasa e xtend (también llamada elongación) o continúe el etapa de polimerización a partir de la imprimación.
La PCR se logra ciclando rápidamente entre estas tres etapas: desnaturalización, apareamiento y extensión. El paso limitante de la velocidad es la extensión que limita la longitud del ADN a copiar. Si la plantilla original es solo una copia, tendríamos 2 copias después de la finalización de un ciclo. El ciclo posterior tendría 4 copias, luego 8, luego 16, luego 32, y así sucesivamente. El proceso de duplicación es exponencial por lo que a partir de 1 copia sometiéndose a 30 ciclos; tendríamos 2 30 o 1,073,741,824 ejemplares. Esto es más de mil millones de copias en pocas horas de tiempo.
Amplificación exponencial por PCR. Crédito: Jeremy Seto (CC-BY 3.0)
Recursos Externos
- Tutorial de los pasos en PCR
- www.dnalc.org/view/15924-hacer-muchas-copias-de-DNA.html