11.4: Medición cuantitativa de ácidos nucleicos

PCR Cuantitativa (qPCR)

Se pueden realizar mediciones de genes individuales de interés a través de PCR de esos genes específicos. Se utiliza un proceso conocido como PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR) para medir genes individuales mediante mediciones de fluorescencia. Un agente intercalante que se une solo al ADN bicatenario llamado Sybr Green se usa en una máquina de qPCR que está midiendo la fluorescencia después de cada ciclo de PCR indica indirectamente la cantidad de producto amplificado. Sin embargo, los productos no específicos de amplificación también pueden medirse y no discriminarse del amplicón auténtico.

Una alternativa a Sybr Green es ejemplificada por la tecnología TaqMan. Con TaqMan, se diseña un tercer cebador (sonda TaqMan) en el centro del área a amplificar. Este cebador medio está diseñado con una auto-complementariedad de horquilla para que los extremos 5' y 3′ estén muy cerca. En un extremo, se une un indicador fluorescente mientras que el otro extremo tiene un desactivador que absorbe cualquier señal de fluorescencia. En circunstancias normales, las mediciones de fluorescencia serán muy bajas. Cuando se produce la extensión de PCR, la Polimerasa hidroliza este cebador medio, separando así el inactivador y el informador. El nombre TaqMan es un juego de palabras ya que se imagina que la polimerasa está masticando la sonda como Pacman. Con una mayor distancia entre el desactivador/indicador, ahora se puede medir la señal de fluorescencia de esta sonda. Este método es mucho más específico que Sybr Green. Sin embargo, el uso de sondas específicas aumenta considerablemente el costo.

Ciclos Umbrales (C _t)

Crédito: Zuzanna K. Filutowska (CC-BY-SA 3.0)

La medición de fluorescencia temprana durante el proceso de PCR será muy baja debido al pequeño número de moléculas de ADNbc (Sybr Green) o la mayoría de los cebadores TaqMan que se apagan. Durante esta producción exponencial de ADN, se alcanzará un umbral en el que la fluorescencia aumentará linealmente. Un punto específico donde la fluorescencia es claramente medible se llama Ciclo Umbral (C _t) se usa como punto de referencia para comparar valores de expresión.

Al observar el ejemplo de qPCR Sybr Green anterior, se puede observar que las muestras que aumentan exponencialmente a un número de ciclo menor (C _t) tienen un mayor nivel de expresión de ARNm (hacia la izquierda) de ese gen que las muestras con mayor número de ciclos (hacia la derecha). Observe que la fluorescencia eventualmente se estaciona y deja de aumentar. Esto se debe al agotamiento de materias primas para la producción de ADN como los dNTPs.

Dado que las reacciones de PCR representan teóricamente una duplicación del ADN después de cada ciclo, los valores de _Ct pueden interpretarse en un sistema de base 2. Si hay una diferencia en C _t entre dos muestras (ΔC _t) de 5 ciclos, esto corresponde a 2 ⁵ o 32 veces diferencia. Podemos controlar las variaciones en la preparación del ARN comparando los valores de fluorescencia de nuestro gen de interés con un gen constitutivo como la actina. El uso de un gen doméstico para normalizar el ingreso inicial a las reacciones y la comparación entre muestras se conoce como Cuantificación Relativa.

Curvas de fusión para Sybr Green

El panel superior ilustra la disminución de la fluorescencia a medida que aumenta la temperatura debido a la disociación del ADN bicatenario. El panel inferior ilustra la gráfica de la primera derivada. Cada pico en este ejemplo ilustra un alelo diferente. Los picos dobles representan la presencia de los 2 alelos distintos en los productos de amplificación.

Crédito: Negocio Seans Potato (CC-BY-SA 3.0)

Al usar Sybr Green, necesitamos asegurarnos de que la PCR sea específica para que la medición de fluorescencia refleje realmente la amplificación de nuestro gen de interés. Al final de cada ejecución de qPCR (~40 ciclos), se realiza una curva de fusión. Una curva de fusión (o curva de disociación) proviene de mediciones constantes a medida que aumenta la temperatura. A medida que aumenta la temperatura, las cadenas de ADN comienzan a desnaturalizarse y la fluorescencia comenzará a disminuir. Después de la separación completa de las cadenas de ADN, la fluorescencia volverá a permanecer constante. La forma en que se ve esta curva es a través de una gráfica derivada donde la inflexión en la lectura de fluorescencia se reporta como la temperatura de fusión (Tm).

Esta curva de fusión ilustra que cada muestra contiene el mismo producto específico con una temperatura de fusión de 83,51°C.

Cualquier pico en esta gráfica se refiere a un producto específico de PCR. Si aparecen múltiples picos, los resultados no serán válidos ya que no miden directamente un solo producto.

Mediciones de Expresión

La expresión génica diferencial se refiere a programas transcripcionales activados por la célula bajo diversas condiciones. “Diferencial” se refiere a una comparación de dos o más estados o puntos de tiempo. Usando el ARNm como medida indirecta de la proteína, se puede determinar qué proteínas están vinculadas a estos diferentes estados. En eucariotas, esto se puede evaluar enriqueciendo el ARN total para el ARNm maduro que contiene poliA. Mediante el uso de resina que contiene oligo- (dT), el ARNm se puede separar del ARN que no codifica proteínas. De igual manera, realizar una transcripción inversa utilizando un cebador oligo- (dT) creará una molécula de ADN complementario estable (ADNc) que se puede usar con PCR. El uso de qPCR de esta manera se denomina RT-PCR o reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa donde se utilizan pares de cebadores específicos para amplificar una pequeña porción de un gen conocido.

Métodos Basados en Hibridación y Microarrays:

Crédito: FrozenMan (CC-BY-SA 4.0)

Previo a la RT-PCR, se evaluó la expresión de genes individuales a través de un enfoque basado en hibridación. Este método requiere ejecutar ARN en un gel de agarosa y transferir los ARN fraccionados por tamaño a una membrana a través de un método llamado “transferencia”. Este ARN transferido se hibridó a una sonda marcada radiactivamente para un gen específico (correspondiente a la secuencia complementaria inversa) y se visualizó por exposición a película de rayos X en un proceso llamado Northern Blot. La intensidad de la banda sería proporcional a la cantidad de ARNm correspondiente al gen de interés. El re-sondeo con un gen constitutivo como actina se usaría como control de carga para ilustrar que se cargó una cantidad similar de ARN total en cada pocillo. Las diferencias en los tamaños del ARNm en la Northern Blot también revelaron diferencias en las variantes de corte y empalme de ARNm maduro en los diferentes estados.

Crédito: Jeremy Seto (CC-BY-NC-SA)

Esta técnica se adaptó posteriormente mediante métodos no radiactivos. Usando estos métodos no radiactivos, se desarrolló el protocolo inverso para medir múltiples dianas génicas. Al inmovilizar sistemáticamente sondas específicas de genes en una membrana o un portaobjetos de microscopio, se puede producir una matriz de dianas. En el paradigma más simple de tener 2 estados (control o experimental), el ADNc de cada muestra puede usarse para generar ARN fluorescente que puede hibridar con sondas inmovilizadas. El uso de 2 marcadores fluorescentes diferentes permite la hibridación competitiva sobre la matriz, por lo que la señal fluorescente en cada canal puede revelar la expresión génica diferencial de los dos estados en una micromatriz de 2 colores.