15.1: Introducción
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Expresión de Proteínas
La tecnología de ADN recombinante tiene muchos usos en la investigación científica básica para comprender mejor la naturaleza de los seres vivos. Como herramienta, la tecnología de ADN recombinante puede ser utilizada para expresar proteínas hacia aplicaciones médicas. Previo a la biotecnología, la diabetes tipo I (insulinodependiente) se trató mediante inyección de insulina aislada del páncreas de cerdos. Con la capacidad de expresar proteínas humanas dentro de bacterias, levaduras y otras células, ya no es necesario sacrificar cerdos por insulina porcina.
El vector de expresión bacteriana pGEX-3X contiene el gen ampR, el origen de replicación, MCS aguas abajo del promotor híbrido lac/trp (tac) y la secuencia codificante de glutatión-S-transferasa (GST). GST actúa como una etiqueta que se fusiona directamente con la proteína del gen de interés y se usa para purificar la proteína con una resina de glutatión.
Las bacterias u otras células se pueden diseñar para expresar proteínas a través del proceso de clonación y transformación. Las bacterias son ventajosas debido a su rápido ciclo de vida y facilidad de crecimiento. Un vector de expresión bacteriana contiene las características básicas del plásmido: el origen de replicación así como el gen de resistencia a antibióticos. A menudo, se utilizará una etiqueta de afinidad para ayudar en la purificación de la proteína. Un ejemplo en el vector anterior muestra la etiqueta GST (glutatión-s-transferasa) que se puede purificar con resina de glutatión. La expresión es solo el primer problema ya que las bacterias también están sintetizando proteínas que se requieren para que las bacterias crezcan y se dividan. Inyectarse estas proteínas además de la insulina provocaría una reacción inmune que podría ser mortal. Por lo tanto, se requiere que las proteínas sobreexpresadas sean purificadas y aisladas de otras proteínas indeseables.
Crédito: Stewart EJ, Madden R, Paul G, Taddei F (CC-SA 3.0).
Criterios para elegir un sistema de expresión
Los sistemas de expresión de proteínas tienen ventajas y desventajas inherentes. En la tabla anterior se resume la comparación de los diversos sistemas celulares de producción (Fernandez & Hoeffler, 1999).
Purificación
Se pueden aplicar diferentes métodos de aislamiento dependiendo de las propiedades de la proteína. La cromatografía de intercambio iónico es útil si la proteína de interés tiene una carga específica que interactuará con una resina empaquetada con la carga opuesta.
Inmunoprecipitación
Inmunoprecipitación: La columna está empaquetada con agarosa Proteína-A que se une a anticuerpos. Los lisados celulares se cargan luego en las columnas donde fluyen y se les permite interactuar con el anticuerpo. Se realizan lavados para eliminar las proteínas unidas no específicamente. Se usa un tampón de elución para interrumpir la interacción del anticuerpo con la proteína diana.
Purificación por afinidad
La purificación por afinidad emplea el uso de anticuerpos específicos que se unen a la proteína de interés muy fuertemente para retenerla en una columna. Con estas técnicas, la proteína retenida en la resina se lava numerosas veces para eliminar otras proteínas que no se pegan específicamente. Luego se usa un cambio en el pH o en las condiciones iónicas para interrumpir la interacción con la resina y eluir las proteínas de la columna. Las proteínas que se diseñan para contener etiquetas pueden purificarse mediante anticuerpos específicos para esas etiquetas. Además, la adición de 6 o más residuos de Histidina consecutivos al final de una proteína los hace susceptibles de purificación con resina de níquel-NTA o purificación de Cobalto. En estos casos, la etiqueta 6xHis asociada con estos iones metálicos en la resina se adhieren selectivamente.
Resina NTA de níquel coordinando la captura de una proteína etiquetada con 6His.
Exclusión de tamaño
Crédito: Midriático (CC-BY-SA 3.0)
Crédito: Takometer (CC-BY 2.5)
La mayoría de ustedes están familiarizados con los filtros de purificación de agua. Antes de usar estos filtros, los sumerges en agua y los residuos oscuros se filtran. Este residuo oscuro es carbón activado. El carbón activado tiene pequeños poros microscópicos que atrapan objetos pequeños como iones y otras partículas. El objetivo principal de estos filtros es eliminar los metales y el cloro que se encuentran en el agua del grifo. La naturaleza porosa del carbón activado lo hace útil para atrapar moléculas en sistemas de purificación de agua.
El proceso utilizado para atrapar estas pequeñas partículas se denomina exclusión por tamaño. A diferencia de la electroforesis en gel de agarosa donde las partículas más pequeñas navegan a través de la matriz más rápido, las resinas de exclusión por tamaño atrap
Cuanto más pequeña es la molécula, más tiempo pasan dentro de los poros a medida que atraviesan la matriz.
Importancia de la Purificación
Crédito: Hans Hill ewaert (CC-BY)
Todos los medicamentos inyectables deben estar limpios de endotoxinas de bacterias. La purificación de la proteína de interés a partir de lisados bacterianos elimina los materiales patógenos peligrosos que de otro modo activarían la reactividad inmune del huésped.
El cangrejo herradura (Limulus polyphemus) desempeña una función especial en el ecosistema al proporcionar huevos para que las aves migratorias se alimenten. Este organismo también alberga un tipo celular especial en su hemolinfa. La prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) es el ensayo más sensible para detectar endotoxinas de bacterias. Los amebocitos se recolectan de estos organismos para su uso en lotes de pruebas de medicamentos inyectables para garantizar una purificación y seguridad adecuadas.
Referencias
- José M. Fernández y James P. Hoeffler. Introducción: MUCHAS POSIBILIDADES: CÓMO ELEGIR UN SISTEMA PARA LOGRAR TU OBJETIVO ESPECÍFICO, Prensa Académica, San Diego. 1999, Páginas 1-5, ISBN 9780122538407. http://dx.doi.org/10.1016/B978-012253840-7/50001-8.