15.2: Purificación de Proteínas (Actividad)

Exclusión por tamaño de moléculas de tinte

Como demostración, el instructor puede ilustrar el concepto de exclusión por tamaño en un conjunto de colorantes alimentarios mixtos.

Cromatografía de exclusión por tamaño de colorante alimentario.

1. Deje que la columna se vacíe sobre un vaso de precipitados.
2. Cargue con cuidado 0.2 ml de mezcla colorante para alimentos en la columna.
3. Coloca 10 tubos en una gradilla debajo de la columna.
4. Colocar un tampón de 1 ml en la columna y recoger fracciones de 0.5 ml.
5. Continuar agregando tampón 1 ml a la vez hasta que se hayan recolectado todas las fracciones.

Exclusión por tamaño de proteínas

Este ejercicio busca purificar la Proteína Verde Fluorescente (GFP) o la Proteína Azul Fluorescente (BFP) a partir del lisado bacteriano. Estas proteínas tienen un tamaño específico de 238 aminoácidos y son 40,000 daltons (40kD). Con base en su tamaño específico, tendrán una tasa específica de migración a través de la resina de exclusión por tamaño. Recuerda que el lisado bacteriano está lleno de proteínas adicionales que no son tu proteína de interés que estamos intentando aislar.

Modelo 3D de GFP (Superior Izquierda), BFP (Arriba Derecha), Alineación estructural de GFP y BFP (Centro) y la alineación de secuencia (Inferior) que ilustra los 3 cambios de aminoácidos para producir la proteína alternativa. Los asteriscos rojos indican la ubicación de las mutaciones.

Se recogerán gotas de líquido en fracciones. Las fracciones que contienen las proteínas fluorescentes se encontrarán únicamente en fracciones específicas que serán visibles bajo iluminación UV.

1. Montar verticalmente la columna en un soporte de anillo. Asegúrate de que sea recto.
2. Deslice la tapa sobre la boquilla en la parte inferior de la columna.
3. Mezcle la suspensión (tamiz molecular) a fondo agitando o agitando suavemente.
4. Pipetear con cuidado 2 ml de la suspensión mezclada en la columna dejándola fluir por las paredes internas de la columna.
5. Coloque un vaso vacío debajo de la columna para recoger el tampón de lavado.
6. Retire la tapa de la parte inferior de la columna y permita que la matriz se empaque en la columna.
7. Etiquetar ocho tubos de microcentrífuga #1 -8.
8. Cargar lentamente la columna con 0.2ml del extracto de GFP. Permita que el extracto ingrese completamente a la columna.
9. Añadir 1 ml del tampón de elución encima de la resina sin perturbar la resina.

• Agregar tampón lentamente (varias gotas a la vez) para evitar diluir la muestra de proteína.
• Usando las marcas graduadas en los lados de los tubos, recoja fracciones de 0.5ml en los tubos de microcentrífuga etiquetados.
• Continúe agregando 1ml de tampón y recoja las fracciones hasta que todos los tubos estén llenos.

10. Verifique todas las fracciones usando luz UV de onda larga para identificar tubos que contienen las proteínas fluorescentes GFP o BFP.
11. La purificación adicional se puede realizar con una resina diferente con las pocas fracciones que contienen la proteína de interés.
12. Las muestras de proteínas deben procesarse en un gel de acrilamida y teñirse contra todas las proteínas para verificar la pureza de la muestra o las mediciones de fluorescencia tomadas.