3.1.3: Realización del protocolo de PCR de cadena principal linealizada

Protocolo de PCR para cadenas principales linealizadas

*Todos los procedimientos copiados o modificados del protocolo lineal backbone de iGem y el protocolo Q5 ^® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix Protocol *

1. Crecer parte BBA_J04450 a partir del plásmido iGEM. Crecer 1 parte por cada estructura principal diferente (pSB1c3, PSB1k3, PSB1t3, PSB1a3)
2. Aislar el ADN del cultivo y obtener la concentración de ADN (vía Denovix/Nanodrop/Qubit)
3. Hacer la mezcla de reacción de PCR para amplificación plasmídica usando la siguiente tabla:

*Mantenga todo en hielo y etiquete los tubos de PCR antes de comenzar. Siempre agregue la ADN polimerasa por último ya que se hundirá hasta el fondo. Utilice la\(\mu L\) reacción 50 para esqueletos lineales. Por lo general, 1µL de ADN es suficiente. *

Componente	25 uL Reacción	Reacción de 50 uL	Concentración Final
Mezcla maestra 2X de alta fidelidad Q5	12.5 uL	25 uL	1X
10 uM de cebador directo (SB-Prep-3P-1)	1.25 uL	2.5 uL	0.5 uM
10 uM Imprimación inversa (SB-Prep-2EA)	1.25 uL	2.5 uL	0.5 uM
ADN molde (pSB1c3, A3, K3, T3)	Variable	10 ng	< 1,000 ng
Agua Destilada	hasta 25 uL	hasta 50 uL

Cebadores para la cadena principal lineal:

SB-prep-3p-1 gccgctgcagtccggcaaaaaa,

SB-Prep-2ea atgaattccagaaatcatccttagcg

4. Coloque el tubo en el termociclador, asegurándose de que no haya burbujas y que las tapas estén cerradas herméticamente

5. Ajustar el termociclador a los siguientes ajustes para la amplificación plasmídica:

Paso	Temperatura	Tiempo
Desdesnaturalización inicial	98°C	30 segundos
25-35 Ciclos	98°C	10 segundos
	66°C	30 segundos
	72°C	3 minutos
Extensión Final	72°C	1.5 minutos
Hold	4°C

6. Ejecutar 1 ul del producto de PCR sin purificar en un gel para verificar el tamaño de banda y la concentración
correctos a. pSB1c3 = 2077 pb
b. pSB1a3 = 2155 pb
c. pSB1 K3 = 2204 pb
d. pSB1t3 = 2461 pb

7. Use un kit de limpieza de PCR para purificar las muestras (se recomienda Qiagen o ZymoPure)

8. Concentración de prueba del producto de PCR purificado (vía Denovix/Nanodrop/Qubit) *El rendimiento esperado debe ser de 40 ng/ul o superior

9. Ejecutar una digestión con el producto de PCR purificado

1. Digestión:
   1. 4 uL 10X NEB Buffer 2.1
   2. 1 uL EcoRi-HF
   3. PSTi de 1 uL
   4. 1 ul de DpnI (Se usa para digerir cualquier ADN molde de la producción)
   5. 25 uL PCR Producto plasmídico linealizado (usar la cantidad total del producto de PCR purificado)
   6. Digerir a 37 °C durante 3 horas
   7. Matanza por calor a 80 °C durante 20 minutos

10. Purificar por PCR usando el mismo kit que antes, cuantificar la concentración de ADN y ajustar la concentración final del plásmido a 25 ng/ul usando agua destilada

11. Ligar cada cadena principal purificada a otra parte plasmídica. También configura un tubo de control para cada columna vertebral. (Este tubo no tendrá NINGÚN inserto agregado y solo tendrá agua agregada en su lugar. Esto prueba con qué frecuencia la columna vertebral simplemente se cierra sobre sí misma en lugar de ligar el inserto en su interior).

* Elija una pieza con un inserto relativamente grande que sepa que es correcto y tenga mucho de sobra. Digerir 300 ng del plásmido con EcoRI y PstI de acuerdo con la instrucción de Doble Digestión. Inactivar por calor la muestra*

1. Ligadura:
   1. 1 ul de esqueleto plasmídico digerido con E/P purificado (25 ng)
   2. Cantidad equimolar de fragmento digerido con E/P (2 uL)
   3. 1 ul de tampón de ADN ligasa T4
   4. 0,5 ul de ADN ligasa T4
   5. Agua destilada hasta 10 uL
   6. Ligar a 16°C durante 30 minutos
   7. Matanza por calor a 80 °C durante 20 minutos

12. Transformar 25 ul de bacterias (se recomienda JM109) con 1-2 ul de producto de ligación

*Consulte el protocolo “Transformación celular: Transformación Zippy de células competentes en Z” anterior para obtener información sobre cómo realizar una transformación*

13. Placa sobre la placa antibiótica apropiada de acuerdo con el gen de resistencia de la columna

Cualquier colonia en las placas de control solo con la estructura principal representa el fondo del proceso de ensamblaje de tres antibióticos. Si hay demasiados, esto podría presentar un problema durante los proyectos estudiantiles. Muchas colonias en la cadena principal+placas de inserción indican que las cadenas principales se amplifican y cortan de manera efectiva para ser ligadas a insertos de corte E/P.