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16.5: Explosión de imprimación

Última actualización

29 oct 2022
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- 16.4: PCR en Silico
- 16.6: Análisis Morfomético

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Primer-Blast es una combinación de un programa llamado Primer3 que ayuda en el diseño de cebadores con propiedades específicas y BLAST. Primer-Blast permite la construcción de cebadores para qPCR donde el usuario puede especificar la temperatura de fusión, reducir la cantidad de autocebado y ampliar las uniones exón-exón para evitar la amplificación del ADN genómico contaminante. Después del diseño de los cebadores, cada par de cebadores se envía a BLAST para identificar si también se cebarán y amplificarán productos similares dentro del genoma del organismo modelo. Este proceso asegura que los cebadores diseñados caigan dentro de sus parámetros de diseño y muy probablemente solo amplifiquen su gen de interés.

Ingresar la secuencia O el número de acceso del NCBI para el gen de interés.
Defina la longitud del producto de PCR.
1. Limitar el producto entre 100-500 permite una buena eficiencia en qPCR.
2. Es posible que los productos más largos no se repliquen de manera eficiente según su protocolo de ciclismo.
Definir la temperatura de fusión deseada (T _m) de los cebadores (la mínima, óptima, máxima, diferencia entre el conjunto).
1. 60ºC es bastante alto y ayudará a mejorar la especificidad del cebador con la diana durante la amplificación para evitar el cebado falso.
2. Trate de tener los T _m lo más cerca posible para que estén recociendo aproximadamente por igual.
Elija la opción “La imprimación debe cubrir una unión exón-exón”.
1. Esto ayuda a amplificar el ADNc y no el ADN genómico que puede ser contaminante.
2. No seleccione esto si se trata de un solo gen exón ya que este fallará.
Seleccione el ARNm de Refseq como la base de datos en la que desea buscar.
1. Refseq proporciona secuencias a secuencias de origen natural.
2. Cosas como secuencias plasmídicas o construcciones vectoriales no aparecen en Refseq.
Selecciona el organismo contra el que estás volando.
1. Hay opciones para organismos modelo así como líneas celulares.
2. Si estás usando algo así como células PC12, puedes usar el genoma de Rattus norvegicus o PC12 ya que eso también es una opción en la base de datos.
Evaluar la ubicación de los cebadores y los demás parámetros. Generalmente elegimos cebadores en el extremo 3" del ARN ya que las reacciones de RT a menudo tienen un sesgo de 3" en eucariotas mediante el uso de cebado oligo-dT en la transcripción inversa.

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