1.6: Espectrofotometría

Objetivos de aprendizaje

Metas:

• Identificar las principales características del espectrofotómetro y definir sus funciones.
• Utilice un espectrofotómetro para obtener un espectro de absorbancia.

Resultados de aprendizaje de los estudiantes:

Al finalizar este laboratorio, los estudiantes serán capaces de:

• Identificar las partes de un espectrofotómetro y sus funciones relacionadas.
• “Blank” un espectrofotómetro.
• Obtener un espectro de absorbancia para una molécula.
• Utilice los escaneos de absorción de longitud de onda para determinar los tintes en bolos de colores.

Introducción

Los espectrofotómetros son una de las herramientas más utilizadas por los científicos para determinar tanto la presencia como la concentración de químicos disueltos. A medida que la energía radiante (luz visible) golpea la materia, las moléculas absorberán ciertas longitudes de onda de la luz y transmitirán o reflejarán otras en función de la naturaleza de sus enlaces químicos. Por ejemplo, las proteínas y los ácidos nucleicos absorben longitudes de onda en el rango de luz visible de 240-300 nanómetros (nm), los pigmentos y colorantes absorben la luz en el rango de 400-770-nm, y otras moléculas orgánicas absorben longitudes de onda superiores a 770-nm. Cada producto químico tiene una disposición atómica y un patrón de unión distintivos, y así absorbe o transmite diferentes longitudes de onda de luz visible en un patrón que es único para ese químico. Este patrón único de absorción de luz y transmitancia crea una “huella digital” para ese químico. En este ejercicio determinarás la “huella digital” única para una molécula coloreada y utilizarás un espectrofotómetro para medir la concentración de un químico en una muestra dada.

Figura 1: Curva de absorbancia y transmisión de luz

Los espectrofotómetros son instrumentos diseñados para detectar la cantidad de energía luminosa que es absorbida o transmitida por moléculas disueltas en una solución. Dado que las moléculas tienen longitudes de onda únicas para su estructura, se pueden identificar diferentes químicos y sus concentraciones en función de su absorbancia o transmitancia.

Figura 2. Partes etiquetadas de un espectrofotómetro

Un espectrofotómetro es un instrumento utilizado para detectar la presencia de cualquier partícula absorbente de luz disuelta en una solución y para medir la concentración de esas partículas. Una fuente de luz dentro del espectrofotómetro emite un espectro completo de luz blanca hacia un compartimento donde se coloca un líquido de muestra. Las muestras se preparan en cubetas que se realizan utilizando plásticos especializados o cuarzo para que no absorban ninguna luz y no afecten nuestras medidas. Antes de que la luz pase a través de la muestra en la cubeta, un prisma ajustable y una rejilla de difracción filtran la luz para que solo se pueda seleccionar una sola longitud de onda de luz y permitir que pase a través de la muestra. Todas las moléculas difieren en qué tan fuertemente absorben cada longitud de onda de luz en el espectro visible debido a diferencias en su estructura molecular y composición. Esto nos permite utilizar una longitud de onda específica de luz para detectar la presencia de, y cuantificar, un compuesto molecular en una mezcla líquida simple o compleja. Los espectrofotómetros también se calibran usando una solución “en blanco” que preparamos que contiene todos los componentes de la solución a analizar excepto el compuesto que estamos probando para que el instrumento pueda poner a cero estas lecturas de fondo y solo reportar valores para el compuesto de interés.

La luz que pasa a través de una solución de muestra será absorbida parcialmente por las moléculas presentes en la muestra. La cantidad de luz que no puede pasar a través de una muestra se mide como el valor de absorbancia. La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de las moléculas y se mide en una escala logarítmica de 0 a infinito. La cantidad de luz que no se absorbe se transmite o pasa a través de la muestra. En comparación con la cantidad de luz que ingresa a la muestra, la cantidad que sale se mide como porcentaje de la luz transmitida. El porcentaje de transmitancia es inversamente proporcional a la concentración de las moléculas en la muestra y se mide en una escala lineal de 0% a 100%.

Figura 3: La luz es absorbida y transmitida a través de la cubeta del espectrofotómetro y la solución

Un fotodetector en el otro lado del compartimento de muestra convierte la intensidad de la luz que recibe en una señal eléctrica. El instrumento puede entonces calcular y mostrar los valores de absorbancia y% de transmitancia midiendo la diferencia entre la intensidad de luz de la longitud de onda seleccionada que entra y sale de la muestra.

La escala de absorbancia refleja la medida de la cantidad de luz absorbida y convertida en unidades de absorbancia (\(A\)) por el espectrofotómetro. Las unidades de absorbancia se calculan usando la siguiente ecuación:

Ecuación 1

\[\text{Absorbance} (A) = \log_{10} \left(\dfrac{1}{T}\right) \nonumber\]

donde “\(T\)” es la forma decimal de “\(\%T\)”

\[T = \dfrac{\%T}{100} \nonumber\]

Ejemplo

Si se encuentra que una solución que contiene un colorante dado transmite el 10% de la luz cuando se coloca en un espectrofotómetro, su absorbancia se calcularía de la siguiente manera:

Transmitancia (T) = 10% = 10% /100 = 0.10

Absorbancia (A) = log 10 (1/0.10) = 1.0

Parte I: Identificación de colorantes alimentarios en caramelos

Muchos alimentos, medicamentos y cosméticos se colorean artificialmente con tintes alimentarios aprobados por el gobierno federal (tintes FD y C). Estos tintes incluyen Rojo 40, Rojo 3, Amarillo 5, Amarillo 6, Azul 1 y Azul 2. Dado que cada colorante tiene un espectro de absorción y pico identificables, se puede usar un espectrofotómetro para identificar los tipos de tinte FD y C utilizados en un producto.

Los pigmentos pueden extraerse de alimentos y bebidas que contienen uno o más de estos tintes. Un espectro de absorción de ese extracto puede entonces determinar qué colorantes hay en ese alimento o bebida comparando los picos de máxima absorbancia con la información de la tabla a continuación. Si el espectro de absorción de un extracto alimenticio tiene un pico a 630 nm y uno a 428 nm, se puede suponer que el alimento contiene tanto Azul #1 como Amarillo #5. La siguiente tabla da la longitud de onda del pico de absorbancia para cada uno de estos colorantes.

Cuadro 1. Longitud de onda de la absorbancia máxima de los tintes FD y C de uso común

Tinte FD y C	Nombre	Longitud de onda (nm) de absorbancia máxima
Azul #1	Azul Brillante FCF	630
Verde #3	Verde Sólido FCF	625
Azul #2	Índigo Carmín	610
Rojo #3	Erithrosine	527
Rojo #40	Allura Rojo AC	502
Amarillo #6	Amarillo Atardecer FCF	484
Amarillo #5	Tartrazina	428

Materiales

• Espectrofotómetro
• Cubeta
• Bolos
• KimWipes
• Tubos de ensayo

Procedimiento

A. Extracción de Tinte de Dulces (Tu Instructor hará esto por ti)

Necesitará un tubo de ensayo y una cubeta para cada color a probar. Mida 4 mL de agua en un tubo. Colocar 2-4 caramelos del mismo color en un tubo de ensayo con el agua. Gira suavemente y espera un minuto. Después, vierta aproximadamente 1 mL de líquido en un tubo de microcentrífuga. Girar el tubo de microcentrífuga a velocidad máxima durante 60 segundos. Asegúrese de que la centrífuga esté equilibrada antes de girar. Transfiera el líquido transparente (sobrenadante) a una cubeta. Asegúrese de dejar atrás las partículas (pellet).

Figura 4. Curva de absorbancia

B. Medición de la absorbancia con espectrofotómetro

1. Encienda el espectrofotómetro. Déjalo calentar por 15 minutos.
2. Seleccione escaneo de longitud de onda.
3. Llene una cubeta 2/3 llena con agua DI para que sirva como la cubeta “BLANK”.
4. Calibrar el espectrómetro

1. 1. Limpie el exterior de la cubeta BLANK con un KimWwipe
   2. Colocar la cubeta en la máquina para que las porciones transparentes de la cubeta estén orientadas de izquierda a derecha. (La luz necesita pasar a través del área clara en la cubeta).
   3. Presione “Cero”
   4. Retire la pieza en blanco.

5. Determine la absorbancia de longitud de onda óptima y establezca el modo de recolección de datos

1. 1. Colocar una cubeta con una muestra en el espectrofotómetro
   2. Prensa “leer”
   3. Establezca el modo de cursor en pico y valle en “Opciones” > “Más” > “Modo cursor”
   4. Presiona las flechas izquierda y derecha a la derecha de la gráfica para seleccionar el pico más alto.
   5. Registrar la longitud de onda y absorbancia en el Cuadro 6.2.

6. Decidir qué tintes se utilizaron para hacer cada color. Ingrese la Longitud de onda de ese tinte en la última columna de la tabla 6.2. Explique su razonamiento para cada elección en su cuaderno de laboratorio.

Resultados

Cuadro 2.

Skittle de color	Absorbancia máxima	Longitud de onda (nm) a máxima absorción	Tinte propuesto	Longitud de onda (nm) de absorción máxima para el tinte propuesto
Rojo
Naranja
Amarillo
Verde
Morado

Instrucciones para Limpieza de Cubetas

1. Descartar soluciones para hundirse
2. Enjuague con agua del grifo una vez
3. Enjuague con agua DI dos veces
4. Colocar en una rejilla para tubos, dejar secar al aire

Preguntas de Estudio

1. Nombrar las partes del espectrofotómetro e identificar su función.
2. ¿Cuál es la diferencia entre% transmitancia y absorbancia?
3. ¿Cómo determinaste qué longitud de onda se absorbió al más alto nivel? ¿Cómo es útil este proceso para determinar la identidad de una molécula?
4. ¿Cómo se limpia una cubeta?