Cebadores de ADN para síntesis
( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\)
Elaboración de cebadores para la síntesis de ADN
La enzima primasa cataliza la síntesis de los cebadores a partir de los cuales las ADN polimerasas pueden comenzar la síntesis (Figura 5.21). Los cebadores son oligonucleótidos cortos, con una longitud de 6 a 60 nucleótidos. Pueden estar hechos de ribonucleótidos o una mezcla de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. La primasa principal en E. coli es la proteína de 60 kDa llamada proteína DnAG, el producto del gen dNAG. La primasa principal en las células eucariotas es la ADN polimerasaα.
La primasa de E. coli, proteína DnAG, no puede sintetizar cebadores por sí misma, sino que es parte de un complejo mucho más grande llamado el primosoma. El primosoma actúa repetidamente durante la síntesis de la cadena retrasada, encontrando un sitio de unión al cebador en la cadena molde monocatenaria recubierta con SSB y sintetizando un cebador. La identificación de los componentes del primosoma fue ayudada por el conveniente sistema modelo de síntesis in vitro del ADN de FX174. FX174 es un bacteriófago monocatenario; el ADN que se encuentra en el virus se denominó cadena plus. Después de la infección por E. coli, esta cadena positiva se convierte en una forma replicativa bicatenaria (Figura 5.24 A). La conversión de ADN de fago monocatenario en ADN dúplex se produce por la síntesis de varios fragmentos de Okazaki, y por lo tanto es un buen modelo para la síntesis discontinua en la hebra rezagada. Esta reacción se puede llevar a cabo in vitro, lo que permitió la disección bioquímica de las diversas etapas en el ensamblaje y movimiento de los primosoma.
| proteína | gen | actividades y funciones |
|---|---|---|
| PRIA | PRIA | helicasa, movimiento de 3' a 5', reconocimiento de sitios |
| PriB | PriB | |
| PriC | PriC | |
| DNat | DNat | necesario para agregar el complejo DNAB‑DNAc al preprimosoma |
| DNac | DNac | formas complejas con DnAb |
| DNab | DNab | helicasa, movimiento de 5' a 3'. ATPasa dependiente de ADN. |
| DnAG | DnAG | sintetizar imprimación |
Cinco proteínas diferentes se encuentran en un complejo de precebado, priA, priB, priC, DnAT y DnAb (Cuadro 5.4). Se necesita una sexta proteína, DNAc, para el ensamblaje de este complejo. En el caso del molde de ADN viral FX174 recubierto con SSB, priA (Figura 5.24 B) reconoce un sitio de ensamblaje del cebador. Luego se añaden las proteínas priB y priC para formar un complejo. La proteína hexamérica DnAb se encuentra en un complejo con seis moléculas de DnAc cuando no está en el ADN. En un proceso dependiente de ATP, y con la ayuda de DNat, DNab se transfiere a la plantilla y se libera DNAc.
El complejo de precebado ya está listo para que la primasa, DnAG, se una y haga el primosoma activo. Aunque el papel de cada una de las proteínas en el primosoma aún no está claro, se dispone de información sobre algunos de los pasos en la acción del primosoma. El sitio de unión preferido en el molde para primasa es CTG, usándose la T como molde para el primer nucleótido de los cebadores. Un complejo de alta afinidad entre DnAb y ATP forma o estabiliza una estructura secundaria en el ADN molde monocatenario que es utilizado por la primasa; se cree que así es como el DnAb “activa” la primasa para comenzar la síntesis. Después de la hidrólisis de ATP por DnAb, el complejo de ADP-DNab de baja afinidad se disocia del molde. El primosoma ahora puede pasar al siguiente sitio para la síntesis de cebadores.
El primosoma contiene dos helicasas que pueden moverse a lo largo del ADN monocatenario con polaridad opuesta. PrIA se mueve en una dirección de 3' a 5', mientras que DnAb se mueve en una dirección de 5' a 3'. Cuando se prueba in vitro con un sustrato similar al mostrado en la Figura 5.22, los fragmentos de cada extremo se desplazan, lo que indica que el primosoma se movió en una dirección sobre algunas moléculas y en la otra dirección en otras. La Figura 5.24 B muestra la migración como impulsada por la helicasa de DnAb, pero el movimiento también puede ocurrir en la otra dirección.
