Polimerasas

De todas las funciones enzimáticas necesarias para la replicación del ADN, la capacidad de catalizar la incorporación de desoxinucleótidos en el ADN es la más central. Las enzimas que catalizan esta reacción, las ADN polimerasas, se han aislado de muchas especies, y muchas especies tienen múltiples ADN polimerasas. Nuestra comprensión más temprana y completa del mecanismo de estas enzimas proviene de estudios de la primera ADN polimerasa aislada, llamada ADN polimerasa I.

Mecanismo de adición de nucleótidos por ADN polimerasas

En 1956 Arthur Kornberg y sus compañeros de trabajo aislaron una proteína de E. coli que tiene muchas de las propiedades esperadas para una ADN polimerasa utilizada en la replicación. En particular, cataliza la síntesis de ADN a partir de desoxinucleótidos, requiere un molde y sintetiza el complemento del molde. Es una sola cadena polipeptídica de 928 aminoácidos, y es el producto del gen poLa. Ahora entendemos que esta es una polimerasa abundante, pero en lugar de sintetizar nuevo ADN en la horquilla de replicación, se utiliza durante el proceso de unión de fragmentos de Okazaki después de la síntesis y en la reparación del ADN. Los estudios detallados de la ADN polimerasa I han sido invaluables para nuestra comprensión de los mecanismos de polimerización. Aunque la ADN polimerasa I no es la polimerasa replicativa en E. coli, las enzimas homólogas se utilizan en la replicación en otras especies. Además, la historia de cómo se detectaron las ADN polimerasas replicativas en E. coli es una ilustración clásica del poder de combinar bioquímica y genética para lograr una comprensión más completa de un proceso celular importante.

La ADN polimerasa I cataliza la polimerización de dNTP en ADN. Esto ocurre por la adición de un dNTP (como dNMP) al extremo 3' de una cadena de ADN, de ahí que el crecimiento de la cadena se produzca en una dirección 5' a 3' (Figura 5.11). En esta reacción, el hidroxilo 3' al final de la cadena en crecimiento es un nucleófilo, atacando el átomo de fósforo en el a-fosfato del dNTP entrante. La reacción procede formando un fosfoéster entre el extremo 3' de la cadena en crecimiento y el fosfato 5' del nucleótido entrante, formando un enlace fosfodiéster con el nuevo nucleótido y liberando pirofosfato (abreviado PPi). Así, en esta reacción, se rompe un enlace fosfoanhídrido en el dNTP y se forma un fosfodiéster. El cambio de energía libre para romper y formar estos enlaces covalentes es ligeramente desfavorable para la reacción como se muestra. Sin embargo, las interacciones no covalentes adicionales, como los enlaces de hidrógeno del nuevo nucleótido a su nucleótido complementario y las interacciones de apilamiento de bases con nucleótidos vecinos, contribuyen a hacer un cambio total de energía libre que es favorable a la reacción en la dirección sintética. Sin embargo, a altas concentraciones de pirofosfato, la reacción puede revertirse. En la reacción en la dirección inversa, los nucleótidos se eliminan progresivamente y se liberan como dNTP en una reacción de pirofosforólisis. Esto es poco probable que sea de gran importancia fisiológica, ya que una pirofosfatasa ubicua cataliza la hidrólisis del pirofosfato a moléculas de fosfato. Esta última reacción se ve fuertemente favorecida termodinámicamente en la dirección de la hidrólisis. Así, las reacciones combinadas de agregar un nuevo nucleótido a una cadena de ADN en crecimiento y la hidrólisis de pirofosfato aseguran que las reacciones globales favorecen la síntesis de ADN. La química básica de adición de nucleótidos a una cadena de polinucleótidos en crecimiento esbozada en la Figura 5.11 es común a prácticamente todas las ADN y ARN polimerasas.

Figura 5.11.Reacción catalizada por ADN polimerasas.

La reacción de síntesis de ADN catalizada por la ADN polimerasa I requiere Mg2+, que es un cofactor para la catálisis, y los cuatro desoxinucleósidos trifosfatos (dNTP), que son los bloques de construcción monoméricos para el polímero en crecimiento. La reacción también requiere una cadena molde de ADN para dirigir la síntesis de la nueva cadena, según lo predicho por el modelo de doble hélice para ADN y confirmado por el experimento Meselson y Stahl.

Esta reacción también requiere de un cebador, que es una molécula (generalmente una cadena de ADN o ARN) que proporciona el hidroxilo 3' al que se agrega el nucleótido entrante. Las ADN polimerasas no pueden iniciar la síntesis en un molde simplemente uniendo dos nucleótidos. En cambio, catalizan la adición de un dNTP a una cadena preexistente de nucleótidos; esta cadena previamente sintetizada es el cebador. El cebador es complementario al molde, y el extremo 3' del cebador se une a la enzima en el sitio activo para la polimerización (Figura 5.12). Cuando se está haciendo una nueva cadena de ADN, una vez que se ha agregado un nuevo nucleótido a la cadena en crecimiento, su hidroxilo 3' es ahora el final del cebador. La polimerasa avanza un nucleótido para que este nuevo extremo del cebador esté en el sitio activo para la polimerización. También es posible la visión alternativa, de que el molde de cebador de ADN se mueve mientras la ADN polimerasa permanece fija. En ambos casos, el último nucleótido agregado es ahora el extremo 3' del cebador, y el siguiente nucleótido en el molde está listo para dirigir la unión de otro nucleósido trifosfato.

Para la síntesis inicial del inicio de una nueva cadena de ADN, un cebador tiene que ser generado por una enzima diferente; esto se discutirá con más detalle más adelante en el capítulo. Por ejemplo, los oligorbonucleótidos cortos son los cebadores para los fragmentos de Okazaki; estos se encuentran en los extremos 5' de los fragmentos de Okazaki y son elaborados por una enzima llamada primasa. Los cebadores de ARN se retiran y se reemplazan con ADN (por ADN polimerasa I) antes de la ligadura.

Estos requisitos para Mg2+, desoxinucleótidos y dos tipos de cadenas de ADN (plantilla y cebador) fueron descubiertos en estudios de ADN polimerasa I. Ahora nos damos cuenta que también son requeridos por todas las ADN polimerasas.

Figura 5.12.Alargamiento de cadena por ADN polimerasa I. La unión del desoxinucleósido trifosfato entrante correcto al sitio activo para la polimerización es dirigida por el desoxinucleótido en la cadena molde. La polimerasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster con el nuevo desoxinucleótido, y luego avanza eficazmente para que el siguiente desoxinucleótido en la plantilla pueda dirigir la unión del siguiente desoxinucleósido trifosfato al sitio activo. Durante la elongación, la nueva cadena de ADN es también el cebador.

El sitio activo de polimerización para la ADN polimerasa I tiene un sitio específico de unión a dNTP (Figura 5.12), y el sitio activo se ajusta al desoxinucleótido en la cadena molde para favorecer la unión del desoxinucleótido complementario en el sitio activo. Así, la polimerasa cataliza la adición a la cadena creciente del desoxinucleótido complementario al desoxinucleótido en la cadena molde.

En la reacción catalizada por la ADN polimerasa I, y todas las demás ADN polimerasas estudiadas, se activa el desoxinucleótido entrante. Los enlaces fosfoanhídrido en forma trifosfato del desoxinucleótido son enlaces de alta energía (es decir, tienen una energía libre de hidrólisis negativa o favorecida), y los fosfatos b y g forman un buen grupo saliente (como pirofosfato) después del ataque nucleofílico. En contraste, el extremo de la cadena de ADN en crecimiento no está activado; es un simple 3'-hidroxilo en el último desoxinucleótido agregado. Esta adición de un monómero activado a un polímero en crecimiento inactivado se denomina mecanismo de crecimiento de cola. Las ADN polimerasas que utilizan este mecanismo solo pueden sintetizar en una dirección 5' a 3', y todas las ADN y ARN polimerasas conocidas hacen esto. Algunas otras macromoléculas, como las proteínas, están hechas por un mecanismo de crecimiento de cabeza. En este caso, el extremo no activado de un monómero ataca el extremo activado del polímero. La cadena alargada nuevamente contiene una cabeza activada (del último monómero agregado).

Ejercicio

Pregunta 5.4. Describir un mecanismo hipotético de crecimiento de cabeza para la síntesis de ADN. ¿En qué dirección ocurre la síntesis de cadenas en este mecanismo?

Corrección del ADN recién sintetizado por una exonucleasa 3' a 5' que forma parte de la ADN polimerasa

La proteína ADN polimerasa I tiene actividades enzimáticas adicionales relacionadas con la síntesis de ADN. Una, una exonucleasa 3' a 5', está íntimamente implicada en la precisión de la replicación. Las nucleasas son enzimas que catalizan la descomposición del ADN o ARN en fragmentos y/o nucleótidos más pequeños. Una exonucleasa cataliza la escisión de nucleótidos del extremo de un polímero de ADN o ARN. Una endonucleasa cataliza el corte dentro de un polímero de ADN o ARN. Estas dos actividades pueden distinguirse por la capacidad de una endonucleasa, pero no una exonucleasa, para cortar un sustrato circular. Una exonucleasa 3' a 5' elimina nucleótidos del extremo 3' de una molécula de ADN o ARN.

La síntesis de ADN debe ser altamente precisa para asegurar que la información genética se transmite a la progenie en gran medida inalterada. Las bacterias como E. coli pueden tener una tasa de mutación, tan baja como una sustitución de nucleótido en aproximadamente 10 ⁹ a 10 ¹⁰ nucleótidos. Esta baja frecuencia de error se logra por una fuerte preferencia de la polimerasa por el nucleótido complementario al molde, lo que permite aproximadamente una sustitución cada 10 ⁴ a 10 ⁵ nucleótidos. La precisión de la síntesis de ADN se ve potenciada por una función correctora en la polimerasa que elimina los nucleótidos incorporados incorrectamente al final de la cadena en crecimiento. Con la corrección, la precisión de la síntesis de ADN se mejora en un factor de 10 ² a 10 ³, por lo que los efectos combinados de la discriminación de nucleótidos en el sitio activo de polimerización más la corrección de pruebas permiten solo aproximadamente una sustitución en 10 ⁶ a 10 ⁸ nucleótidos. La reducción adicional en la tasa de error se logra mediante la reparación de desajuste (Capítulo 7).

La función correctora de la ADN polimerasa I se lleva a cabo mediante una exonucleasa 3' a 5' (Figura 5.13). Se localiza en una región diferente de la enzima del sitio activo para la polimerización. Cuando se agrega un nucleótido incorrecto al extremo 3' de una cadena en crecimiento, la velocidad de polimerización disminuye considerablemente. El molde de cebador se mueve a un sitio activo diferente en la enzima, el que tiene la actividad exonucleolítica de 3' a 5'. El nucleótido incorrecto se escinde, y el cebador-plantilla vuelve al sitio activo de polimerización para reanudar la síntesis. La enzima distingue entre nucleótidos correctos e incorrectos en el extremo 3' del cebador, de tal manera que la exonucleasa 3' a 5' es mucho más activa cuando el término de la cadena en crecimiento no está emparejado de bases correctamente, pero la actividad polimerasa excede la de la actividad exonucleasa 3' a 5' cuando se agrega el nucleótido correcto.

La actividad de polimerización y la corrección de la exonucleasa 3' a 5' que se encuentran en la ADN polimerasa I también se encuentran en la mayoría de las demás ADN polimerasas. Estas son actividades centrales para la replicación del ADN.

Los mecanismos de crecimiento de la cola permiten la corrección y posterior elongación. Si se activara el final de la cadena de crecimiento (como en el crecimiento de la cabeza), entonces la corrección eliminaría el extremo activado y el alargamiento no podría continuar.

D.

A.

C.

B.

Figura 5.13.Escisión de un nucleótido incorrecto por la ADN polimerasa I. La incorporación de un nucleótido incorrecto (por ejemplo, una T opuesta a una C, panel inferior) (A) provoca que el cebador-molde se desplace al sitio activo de la exonucleasa 3'-5' (B) donde se escinde el nucleótido incorrecto (C). Entonces, el molde de cebador puede volver al sitio activo de la polimerasa para reanudar la síntesis (D).

Ejercicio

Pregunta 5.4 La eliminación de un nucleótido del extremo 3' de la cadena en crecimiento por una exonucleasa 3' a 5' no es lo contrario de la reacción de la polimerasa. ¿Se puede decir cuál es la diferencia?

Eliminación de nucleótidos por una exonucleasa 5' a 3' que forma parte de la ADN polimerasa I

Además de la polimerasa y la exonucleasa 3' a 5' común a la mayoría de las ADN polimerasas, la ADN polimerasa I tiene una actividad exonucleolítica inusual de 5' a 3'. Esta enzima cataliza la eliminación de nucleótidos en regiones de bases pareadas y puede escindir ADN o ARN. Es utilizado por la célula para eliminar cebadores de ARN de fragmentos de Okazaki y en la reparación de ADN dañado.

Esta exonucleasa 5' a 3', en combinación con la polimerasa, tiene aplicaciones útiles en el laboratorio. Un uso común es marcar ADN in vitro mediante traducción de mella (Figura 5.14). En este proceso, la ADN polimerasa I eliminará el ADN de una cadena mellada por la exonucleasa 5' a 3', y luego usará el hidroxilo 3' expuesto en la mella como cebador para la nueva síntesis de ADN por la polimerasa 5' a 3', reemplazando así el ADN viejo. El resultado también es un movimiento, o traducción, de la mella de un punto en el ADN a otro, de ahí que el proceso se llame nick translation. Si la reacción se lleva a cabo en presencia de uno o más desoxinucleósidos trifosfatos radiomarcados (por ejemplo, [a ³² P] dNTP), entonces el nuevo ADN se marcará radioactivamente.

Un proceso similar se puede utilizar para reparar el ADN en una célula. Como se discutirá en el Capítulo 7, enzimas específicas reconocen un nucleótido dañado y escinden aguas arriba del daño. Una forma de eliminar el ADN dañado y reemplazarlo con la secuencia correcta es con la exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa I y la síntesis de ADN acompañante.

[a ³² P]

Figura 5.14. La exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa I se puede utilizar en la traducción de mella para marcar ADN in vitro.

Dominios estructurales de la ADN polimerasa I

Se puede obtener una mayor comprensión del mecanismo de las tres funciones enzimáticas de la ADN polimerasa a partir de un estudio de la estructura tridimensional (3-D) de la proteína. Gran parte de nuestro conocimiento de la estructura de la ADN polimerasa I proviene de la caracterización bioquímica y más recientemente de la determinación de la estructura 3-D mediante cristalografía de rayos X. Estos estudios han demostrado que distintos dominios estructurales de la ADN polimerasa I contienen las diferentes actividades catalíticas. Además, la estructura 3-D proporcionó el primer vistazo a lo que ahora se reconoce como una estructura común para muchas polimerasas.

El tratamiento leve con la proteasa subtilisina escinde la ADN polimerasa I en dos fragmentos. El fragmento pequeño contiene la exonucleasa 5' a 3', y el fragmento más grande, o “Klenow” (llamado así por el bioquímico que realizó el análisis de escisión) contiene la polimerasa y la corrección de 3' a 5' exonucleasa (Figura 5.15). Así, las dos actividades comunes a la mayoría de las polimerasas están juntas en el fragmento de Klenow, mientras que la exonucleasa 5' a 3' distintiva está en un dominio separable. El hecho de que un tratamiento suave con una proteasa sin una especificidad de secuencia precisa indica que un dominio expuesto y fácilmente escindido conecta los fragmentos grandes y pequeños. Ambas observaciones sugieren que la exonucleasa 5' a 3' fue un dominio activo agregado a una polimerasa más dominio de corrección durante la evolución de E. coli. La polimerasa Klenow se utiliza en varias aplicaciones en el laboratorio, por ejemplo, marcando los extremos de los fragmentos de restricción rellenando los salientes y secuenciando mediante el método de terminación de cadena de didesoxinucleótidos.

Figura 5.15. La ADN polimerasa I de E. coli tiene tres sitios activos en tres dominios estructurales en un polipéptido.

La estructura tridimensional del fragmento grande de la ADN polimerasa I, determinada por cristalografía, proporciona información adicional sobre las funciones enzimáticas de los componentes estructurales clave. El fragmento grande tiene una hendidura profunda, de aproximadamente 30 Å de profundidad, en la que se unen la cadena molde y el cebador. Esta hendidura se asemeja a una “mano derecha ahuecada” como se ilustra en la Figura 5.16. La “palma” está formada por una serie de láminas b y el pulgar y los dedos están hechos por hélices a. El sitio activo de la polimerasa se ha mapeado dentro de la hendidura profunda, con contribuciones de las láminas b que forman la palma y las hélices a que forman los dedos. Se pueden ver vistas más detalladas de la estructura del fragmento de Klenow en el sitio web Curso/Libro (actualmente www.bmb.psu.edu/cursos/bmb400/default.htm. Haga clic en el enlace a las imágenes cinéticas, descargue el programa MAGE y el archivo de kinemage para ADN polimerasa I, y véalos en su propia computadora.)

La exonucleasa correctora de 3' a 5' se localiza en otra parte de la estructura del fragmento de Klenow, aproximadamente a 25 Å del sitio activo de la polimerasa. Por lo tanto, el extremo del cebador tiene que moverse esta distancia para que la enzima elimine los nucleótidos mal incorporados.

Figura 2 de Kim et al. (1995) Estructura cristalina de ADN polimerasa de Thermus aquaticus, Nature 376:612-616, que muestra los 3 dominios.

El fragmento grande de Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli carece de la exonucleasa 5' a 3', por lo que la estructura 3-D del fragmento de Klenow no da información sobre esa exonucleasa. Sin embargo, el dominio exonucleasa 5' a 3' se puede observar en la estructura de la ADN polimerasa de la bacteria termófila Thermus aquaticus. Esta estructura proteica es muy similar a la de la ADN polimerasa I de E. coli en los dominios polimerasa y exonucleasa 3' a 5', y tiene un dominio exonucleasa 5' a 3' adicional localizado a aproximadamente 70 Å del sitio activo de la polimerasa. Esta es una gran distancia, pero recuerde que esta exonucleasa está trabajando en una región diferente de la molécula de ADN a la de la polimerasa. La exonucleasa 5' a 3' usa una parte de la molécula de ADN como sustrato para extirpar cebadores o eliminar ADN dañado, mientras que la polimerasa usa una parte diferente de la molécula de ADN como molde para dirigir la síntesis de una nueva cadena.

Curiosamente, una región homóloga al dominio exonucleasa 3' a 5' correctora de la ADN polimerasa I está presente en la estructura de la polimerasa de Thermus aquaticus, pero ya no es funcional. La ausencia de corrección explica la elevada tasa de error en esta polimerasa utilizada muy comúnmente para la amplificación del ADN por PCR. Por supuesto, esta polimerasa es utilizada en PCR porque es estable a las altas temperaturas encontradas durante los ciclos de PCR. Algunas otras polimerasas termoestables con una tasa de error más baja están disponibles más recientemente para su uso en PCR.

Estructuras similares de “mano derecha ahuecada” ocurren en la estructura terciaria de la ARN polimerasa T7 y la transcriptasa inversa del VIH. Así la ADN polimerasa I fue el primer miembro descrito en lo que ahora nos damos cuenta de que es una gran clase de polimerasas de ácido nucleico. Esta familia incluye polimerasas de una sola unidad tanto para la síntesis de ARN como de ADN. Puedes acceder a un tutorial sobre la ADN polimerasa T7 en www.Clunet.edu/biodev/omm/exh... s.htm #displays. Esta estructura tiene algunas similitudes con la de la ADN polimerasa I.

Papel fisiológico de la ADN polimerasa I

Si bien los estudios de la ADN polimerasa I han proporcionado mucha información sobre el mecanismo de síntesis de ADN, el análisis genético ha demostrado que la función polimerasa de esta enzima no es necesaria para la replicación del ADN. La ADN polimerasa I está codificada por el gen poLa en E. coli. Sin embargo, no se aisló ningún alelo mutante de poLa en cribas de mutantes condicionales defectuosos en la replicación del ADN. El argumento más convincente de que esta polimerasa no es requerida para la replicación provino de un examen de miles de mutantes de E. coli, analizándolos para determinar la actividad de la ADN polimerasa I. Se aisló una cepa poLa mutante (Figura 5.16). Este alelo mutante, llamado PolA1, contenía un codón sin sentido, conduciendo a la terminación prematura de la síntesis del polipéptido producto y de ahí una pérdida de la función polimerasa. Sin embargo, la cepa mutante creció a un ritmo normal, lo que demuestra que la ADN polimerasa I no es necesaria para la síntesis de ADN. El fenotipo más llamativo del mutante PolA1 fue su capacidad fuertemente reducida para reparar el daño del ADN. Investigaciones posteriores condujeron al aislamiento de alelos letales condicionales del gen poLa. Las proteínas mutantes de la ADN polimerasa I codificadas por estos alelos letales condicionales son defectuosas en la actividad exonucleasa 5' a 3', lo que demuestra que esta actividad es necesaria para la viabilidad celular. La actividad exonucleasa 5' a 3' elimina los cebadores de ARN durante la síntesis de la cadena retardada en la horquilla de replicación, y se usa en la reparación del ADN.

Figura 5.16. Los extractos de una cepa mutante PolA1 son defectuosos en la actividad de la ADN polimerasa. La polimerización de ADN en extractos de células de E. coli se midió mediante la incorporación de dTTP radiomarcado en el ADN. La cepa de tipo silvestre (línea marcada W) mostró alta actividad. Los mutantes de esta cepa fueron sistemáticamente cribados por la pérdida de esta actividad de polimerización de ADN, y se encontró uno (línea marcada P; nótese el cambio de escala desde el panel superior). Esta cepa mutante tiene menos del 1% de la actividad de tipo silvestre, como lo demuestra la mezcla de 1 parte de extracto de tipo silvestre con 99 partes del extracto mutante (una dilución de 100 veces; los resultados se muestran como línea PW). La mutación se mapeó a poLa, que codifica la ADN polimerasa I. La cepa mutante crece así como la de tipo silvestre, demostrando que la ADN polimerasa I no es necesaria para la replicación del ADN. Esta cifra es de De Lucia y Cairns (1969) Nature 224:1164-1166.

La ADN polimerasa III es una polimerasa replicativa altamente procesativa

La conclusión de que la ADN polimerasa I no es la polimerasa replicativa para E. coli condujo a la pregunta obvia de qué enzima se usa realmente durante la replicación. La investigación de los genes aislados en pantallas de mutantes condicionalmente deficientes en replicación condujo a la respuesta. La polimerasa replicativa en E. coli es ADN polimerasa III.

La ADN polimerasa I es más abundante que otras polimerasas en E. coli y oscurece su actividad. Así, el agotamiento de la actividad de la ADN polimerasa I en células mutantes PolA1 (Figura 5.17) brindó la oportunidad de observar las otras ADN polimerasas. Las ADN polimerasas II y III se aislaron de extractos de células PolA1, nombradas en el orden de su descubrimiento.

La ADN polimerasa II es una sola cadena polipeptídica cuya función es incierta. Las cepas que tienen un gen mutado para la ADN polimerasa II (PolB1) no muestran ningún defecto en el crecimiento o replicación. Sin embargo, la actividad de la ADN polimerasa II se incrementa durante la reparación inducida del ADN, y puede funcionar sintetizando ADN opuesto a una base eliminada en la cadena molde.

La evidencia genética muestra claramente que la ADN polimerasa III es utilizada para replicar el cromosoma de E. coli. Esta enzima está compuesta por múltiples subunidades polipeptídicas. Varios de los genes que codifican estas subunidades polipeptídicas se identificaron en cribas de mutantes letales condicionales defectuosos en la replicación del ADN. La pérdida de función de estos genes de adn bloquea la replicación, demostrando que sus productos son requeridos para la replicación.

Baja abundancia y alta procesividad de la ADN polimerasa III

La ADN polimerasa III tiene muchas de las propiedades esperadas para una polimerasa replicativa. Una de las complicaciones de los estudios de ADN polimerasa III es que se aislaron diferentes formas mediante diversos procedimientos. Ahora nos damos cuenta de que estas formas difieren en el número de subunidades presentes en la enzima aislada. Para enzimas con múltiples subunidades, nos referimos al complejo con todas las subunidades necesarias para su función principal como holoenzima u holocomplejo. La holoenzima ADN polimerasa cuenta con diez subunidades, las cuales serán discutidas en detalle en la siguiente sección.

Es la holoenzima ADN polimerasa la que tiene las propiedades esperadas para una polimerasa replicativa, mientras que la ADN polimerasa I no (ver comparación en la Tabla 5.1). Es menos abundante que la ADN polimerasa I, pero no se necesita gran cantidad de ADN polimerasas replicativas en la célula. Solo se pueden usar una o dos polimerasas en cada horquilla de replicación, por lo que bastarán las 10 moléculas de la holoenzima ADN polimerasa III. La ADN polimerasa III cataliza la síntesis de ADN a una tasa considerablemente mayor que la ADN polimerasa I, en un factor de aproximadamente 70. La tasa de elongación medida para la holoenzima ADN polimerasa III (42,000 nucleótidos por min) es cercana a la velocidad de movimiento de la horquilla de replicación medida in vivo en E. coli (60,000 nucleótidos por min).

Una propiedad clave para una ADN polimerasa replicativa es la alta procesividad, que es una característica llamativa de la holoenzima ADN polimerasa III. La procesividad es la cantidad de polimerización catalizada por una enzima cada vez que se une a un molde apropiado, o cebador-molde en el caso de las ADN polimerasas. Se mide en nucleótidos polimerizados por evento de unión. Para replicar el cromosoma 4.5 megabase de E. coli en 30 a 40 min, la ADN polimerasa necesita sintetizar ADN rápidamente y de manera altamente procesiva. La ADN polimerasa I sintetiza menos de 200 nucleótidos por evento de unión, pero como holoenzima, la ADN polimerasa III es mucho más procesiva, superando los límites del ensayo utilizado para obtener los resultados resumidos en la Tabla 5.1. En contraste, el núcleo de la ADN polimerasa III, que tiene sólo tres subunidades (ver siguiente sección), tiene una procesividad muy baja.

Cuadro 5.1. Comparación de ADN polimerasas I y III (Pol I y Pol III)

Propiedad	Pol I	Núcleo Pol III	Holoenzima Pol III
moléculas por célula	400	40	10
nucleótidos polimerizados min-1 (enzima molecular) -1	600	9000	42,000
procesividad [nucleótidos polimerizados por iniciación]	3-188	10	>105
polimerasa 5' a 3'	+	+	+
Exonucleasa de 3' a 5', corrección	+	+	+
exonucleasa 5' a 3'	+	-	-

Nota: + y — se refieren a la presencia o ausencia de la actividad declarada en la enzima.

Pregunta 5.6. Si la tasa de movimiento de la horquilla de replicación medida in vivo en E. coli es de 60,000 nucleótidos por minuto, ¿cuántas horquillas se necesitan para replicar el cromosoma en 40 min? Recordemos que el tamaño del cromosoma de E. coli es de 4.64 '10 ⁶ pb.

Subunidades y mecanismo de la ADN polimerasa III

La enzima ADN polimerasa III tiene cuatro componentes funcionales distintos, y varios de estos contienen múltiples subunidades, como se enumera en la Tabla 5.2 y se ilustra en la Figura 5.18. Las subunidades a y e contienen las principales actividades de polimerización y corrección, respectivamente. Se combinan con la subunidad q para formar el núcleo catalítico de la polimerasa. Este núcleo puede ser dimerizado por la proteína enlazadora t ₂ para formar un subensamblaje llamado ADN polimerasa III'. La adición del tercer componente funcional, el complejo g, genera otro subensamblaje denominado ADN polimerasa III*. Todos estos subensamblajes han sido aislados de E. coli y se han caracterizado extensamente. El componente final es el dímero b2, que cuando se combina con la ADN polimerasa III* forma la holoenzima.

Figura 5.19.

Las diversas actividades de la ADN polimerasa III pueden asignarse a subunidades individuales (Cuadro 5.2). Por ejemplo, la polimerasa principal se encuentra en la subunidad a, que está codificada por el gen DnaE (también conocido como polC). La exonucleasa 3' a 5' está en la subunidad e, que está codificada por el gen dnaQ (también conocido como el gen mutD). Sin embargo, la actividad máxima se obtiene con combinaciones de subunidades. El núcleo de ADN polimerasa III es un complejo de las subunidades a, e y q, y la actividad del núcleo en ambos ensayos de polimerasa y exonucleasa 3' a 5' es mayor en que en las subunidades aisladas.

Cuadro 5.2. Subensamblajes de ADN polimerasa III, subunidades principales, genes y funciones

Componente funcional	Subunidad	Masa (kDa)	Gene	Actividad o función
Núcleo de la polimerasa	a	129.9	Polc=DNAE	polimerasa 5' a 3'
	e	27.5	DNAQ=MUTD	3'-5' exonucleasa
	q	8.6		Estimula la exonucleasa
Proteína enlazadora	t	71.1	DNax	Dimeriza núcleos
Cargador de abrazaderas	g	47.5	DNax	Se une a ATP
(o g complejo)	d	38.7		Se une a b
(ATPasa)	d'	36.9		Se une a g y b
	c	16.6		Se une a SSB
	y	15.2		Se une a c y g
Pinza deslizante	b	40.6	DNan	Factor de procesividad

Las actividades de las subunidades se pueden medir in vitro mediante ensayos bioquímicos apropiados. Además, el fenotipo de mutaciones en el gen que codifica una subunidad dada puede mostrar que la subunidad es requerida para un proceso particular. Las subunidades a mutantes son el producto de alelos letales condicionales descubiertos en pantallas para genes de adn, pero también fueron descubiertos como el producto de alelos defectuosos de polimerasa que definen el gen polC. Así, el gen DnaE es el mismo que el gen polC, demostrando que esta subunidad con actividad polimerasa es necesaria en la replicación. De manera similar, el fenotipo de mutaciones en el gen que codifica la subunidad e muestra que es necesario para la corrección de pruebas. Se identificaron alelos mutantes del gen DNAQ en un cribado de genes mutadores, los cuales generan una alta frecuencia de mutantes en bacterias cuando son defectuosos. Estos alelos definieron un gen mutD, que posteriormente se demostró que era el mismo que el dnaQ. El fenotipo mutador de las cepas mutantes DNAQ/ mutD es el resultado de la falta de corrección por parte de la subunidad e durante la replicación, permitiendo la incorporación más frecuente de nucleótidos incorrectos en el ADN.

El dímero b2 es la proteína clave que confiere alta procesividad a la ADN polimerasa III. La asociación del dímero b2 con la ADN polimerasa III aumenta la procesividad de aproximadamente 10 nucleótidos polimerizados por evento de unión a más de 100,000 nucleótidos polimerizados por evento de unión (Cuadro 5.1). Esta proteína dimérica forma un anillo a través del cual puede pasar el ADN dúplex; el anillo se deslizará fácilmente a lo largo del ADN a menos que se vea obstaculizado, como, por ejemplo, por proteínas unidas al ADN molde. Así, el dímero b2 actúa como una pinza deslizante, sujetando la polimerasa sobre el ADN que se está copiando. Una vez que la ADN polimerasa III se asocia con la pinza en el ADN, polimerizará hasta que alcance el siguiente cebador para un fragmento de Okazaki durante la síntesis de cadenas rezagadas. Para la síntesis de la cadena principal, la ADN polimerasa presumiblemente permanece asociada con el ADN a través de la pinza b2 hasta que el ADN cromosómico se replica completamente. La estructura 3-D del dímero b2, determinada por cristalografía de rayos X, muestra un anillo macromolecular. Esta estructura se puede ver en el sitio web del curso y en el Museo Online de Macromoléculas (www.Clunet.edu/biodev/omm/exh... s.htm #displays).

El complejo g contiene varias subunidades: dos moléculas de subunidades g y una molécula cada una de d, d', c e y, carga la pinza del dímero b ₂ sobre una plantilla de cebador, en un proceso que requiere hidrólisis de ATP (Figura 5.19). El núcleo catalítico de la ADN polimerasa III se unirá entonces a la pinza unida al molde e iniciará una replicación altamente procesiva. El complejo g también sirve para descargar la pinza una vez que se completa un fragmento de Okazaki durante la síntesis de hebras rezagadas; de ahí que sea tanto un cargador de abrazaderas como un descargador, permitiendo que la polimerasa y la pinza ciclen repetidamente de un fragmento de Okazaki a otro.

El complejo g realiza estas actividades opuestas en diferentes estructuras, cargando en la pinza en una plantilla-imprimación y descargando la pinza al final de un fragmento de Okazaki terminado. Por ejemplo, encontrar el extremo 5' del fragmento de Okazaki previamente sintetizado puede ser la estructura distintiva que desplaza el complejo g a su modo de descarga. No descarga la pinza mientras la ADN polimerasa III está catalizando la polimerización.

La Figura 5.19 ilustra los pasos propuestos en este proceso. El complejo g en la forma unida a ATP se une a la pinza b ₂, mientras que el complejo g en la forma unida a ADP libera la pinza b ₂. Así, la carga y descarga dependen de una ronda de hidrólisis de ATP. Cuando el complejo g en la forma unida a ATP se une a la pinza b ₂, la holoenzima ADN polimerasa III se encuentra en una conformación que le permite encontrar una plantilla de cebador. El anillo de la pinza b ₂ se mantiene abierto por el complejo G-ATP, lo que le permite unirse alrededor de una plantilla de cebador. La hidrólisis de ATP por el complejo g lo deja en una forma unida a ADP. En esta nueva conformación unida a ADP del complejo g, se disocia de la pinza b ₂, permitiendo así que la pinza b ₂ se una al núcleo catalítico de la holoenzima y también se cierre alrededor de la plantilla de cebador. La holoenzima ya está lista para catalizar la síntesis procesiva de ADN. El alargamiento continúa hasta que la holoenzima encuentra un fragmento de Okazaki previamente sintetizado. Ahora el complejo g se une al ATP (presumiblemente mediante una reacción de intercambio ADP-ATP) y se desplaza a la conformación para unirse a la pinza b ₂ y sacarlo del molde de ADN. Esta mitad de la holoenzima ahora es capaz de disociarse de la plantilla y encontrar la siguiente unión cebador-plantilla para comenzar la síntesis de otro fragmento de Okazaki.

Las actividades de carga y descarga de pinzamiento del complejo g son un ciclo de cambios en las asociaciones de proteínas. Estos cambios ocurren debido a las actividades enzimáticas del complejo, que a su vez alteran las conformaciones de las proteínas y sus interacciones preferidas. Como se muestra en la Figura 5.19, el complejo g es una ATPasa, que es una enzima que cataliza la hidrólisis de ATP a ADP y fosfato. También es un factor de intercambio ATP-ADP.

Figura 5.19. (Página anterior) Carga y descarga de la pinza b ₂ por el complejo g en la holoenzima ADN polimerasa III. La abrazadera b ₂ se muestra como un anillo que se puede unir y abrir por la forma unida a ATP del complejo g (se muestra como una forma pincher, pero su forma no se conoce). Después de la unión inicial de la pinza b ₂, la hidrólisis de ATP por el complejo g hace que este complejo se desplace a una conformación unida a ADP que le permite liberar la abrazadera b ₂, de modo que la abrazadera b ₂ se carga en el molde de cebador y también se une al núcleo catalítico del polimerasa. Después de completar el fragmento de Okazaki, el complejo g intercambia el ADP por ATP, y ahora es una conformación para unir la pinza b ₂ y descargarla. No se han demostrado todos los pasos en este modelo, pero es útil para ilustrar cómo se podrían usar ciclos de hidrólisis de ATP en la carga y descarga de la pinza b ₂. La figura muestra solo la mitad de la holoenzima ADN polimerasa III dedicada a la síntesis de la cadena rezagada; se cree que la otra mitad se dedica a la síntesis de la cadena principal, pero no se muestra aquí para mantener el diagrama relativamente simple.

Los cambios en la conformación y actividad de las proteínas dependiendo de si están unidas a un nucleósido trifosfato (ATP o GTP) o a un nucleósido difosfato (ADP o GDP) es un tema común en la bioquímica. Las formas de proteínas unidas a GTP, que pueden ser apagadas por hidrólisis de GTP y reactivadas por proteínas de intercambio GDP-GTP, median eventos críticos de señalización celular. Como se verá en el Capítulo 14, las formas de factores de traducción ligados a GTP y GDP llevan a cabo funciones opuestas. Las proteínas asumen diferentes conformaciones dependiendo del cofactor unido (en este caso un nucleótido), y cada conformación tiene una actividad distinta. La capacidad de cambiar la conformación por una actividad hidrolítica (convertir ATP en ADP y fosfato) permite que la proteína cambie las actividades fácilmente.

Los dos núcleos catalíticos de la ADN polimerasa III se unen entre sí por las subunidades t para formar un dímero asimétrico (ver Figura 5.18). La mitad de la holoenzima sin el complejo g se propone para sintetizar la cadena principal del nuevo ADN, y se propone el núcleo con el complejo g para sintetizar la hebra rezagada. Ambos núcleos en el dímero asimétrico están asociados con una abrazadera b2 en la horquilla de replicación. En este modelo, la síntesis tanto de las cadenas principales como de las rezagadas es catalizada por el mismo complejo de ADN polimerasa III, coordinando así la síntesis de ambas cadenas nuevas. Obsérvese que si el molde para la síntesis de cadenas rezagadas se enrolla alrededor de la enzima, entonces la síntesis de la cadena delantera y retrasada se produciría en la misma dirección que el movimiento de la horquilla de replicación (Figura 5.20), a pesar de las polaridades opuestas de las dos cadenas del molde. Así, el modelo de dímero asimétrico sugiere un medio para acoplar tanto la síntesis de la cadena principal como de la cadena retrasada.

Maquinaria de replicación

C.

B.

A.

Figura 5.20. Síntesis simultánea de cadenas tanto conductoras como rezagadas por un dímero asimétrico de ADN polimerasa III. En este modelo, uno de los núcleos catalíticos sintetiza la hebra delantera y el otro sintetiza la hebra rezagada. La plantilla para la hebra rezagada puede estar enrollada alrededor de la polimerasa, haciendo que esta hebra se asemeje al portaobjetos en un trombón (panel A); este modelo se ha denominado modelo Trombone Slide. Cuando esto se hace, la síntesis de los fragmentos de Okazaki está en la misma dirección que la síntesis de la hebra principal y el movimiento de la bifurcación (es decir, de izquierda a derecha en el diagrama). Efectivamente, envolver la cadena molde para la síntesis de la cadena retardada alrededor de la polimerasa orienta esta cadena en el sitio activo en la misma polaridad que el molde para la síntesis de la cadena principal. (A) La enzima primasa produce un cebador en el bucle monocatenario agrandado, mientras que el núcleo de la ADN polimerasa III cataliza la extensión del fragmento de Okazaki. (B) Se completa el fragmento de Okazaki y la ADN polimerasa III se encuentra con el fragmento de Okazaki previamente sintetizado. (C) Ahora se libera el bucle con el fragmento Okazaki completado y se forma un nuevo bucle monocatenario. La ADN polimerasa III inicia la replicación en el cebador en el nuevo bucle, y se reanuda la replicación de la cadena retrasada, moviéndose nuevamente en la misma dirección que la horquilla (y la cadena principal). SSB es una proteína de unión monocatenaria y la primasa cataliza la síntesis de cebadores (que son principalmente ARN) para fragmentos de Okazaki; estos serán discutidos con más detalle más adelante.

Colaboradores y Atribuciones

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