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LibreTexts Español

6.8: Laboratorio 5. Influencia del medio ambiente físico y químico

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    51463
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    Objetivos

    • Determinar el efecto de la actividad acuosa sobre el crecimiento de microorganismos de diferentes ambientes.
    • Determinar el efecto de pH sobre el crecimiento de microorganismos de diferentes ambientes.
    • Determinar el efecto inhibitorio de agentes químicos con distintos mecanismos de acción.
    • Determinar la concentración mínima inhibitoria y la concentración bactericida mínima de un agente químico.

    Desarrollo práctico

    Primer día

    Influencia de la concentración de glucosa y ClNa en el crecimiento

    Cada subgrupo contará con un cultivo líquido de uno de los siguientes microorganismos:

    a) Escherichia coli

    b) Staphylococcus aureus

    c) Staphylococcus epidermidis

    d) Saccharomyces rouxii

    e) Saccharomyces bailii

    Inocular cada uno de los microorganismos en caldo nutritivo con aW controlada usando una ansada de inóculo por tubo, de acuerdo al siguiente esquema:

    % glucosa

    \(a_{W}\)

    E. coli

    S. aureus

    S. epidermidis

    S. rouxii

    S. bailii

    10

    0,990

    20

    0,980

    40

    0,958

    % ClNa

    \(a_{W}\)

    E. coli

    S. aureus

    S. epidermidis

    S. baillii

    S. bailii

    2,5

    0,989

    10

    0,940

    20

    0,875

    Incubar los tubos a 28 y 37ºC, según corresponda, durante 48 h.

    Influencia del pH en el crecimiento

    Cada subgrupo contará con un cultivo líquido de uno de los siguientes microorganismos:

    a) Escherichia coli

    b) Proteus spp.

    c) Lactobacillus spp.

    d) Saccharomyces pombe

    Inocular cada uno de los microorganismos en caldo nutritivo con distintos valores de pH usando una ansada de inóculo por tubo, de acuerdo al siguiente esquema:

    pH

    E. coli

    Proteus sp.

    Lactobacillus sp.

    S. pombe

    4

    7

    10

    Incubar los tubos a 28 y 37º C, según corresponda, durante 48 h.

    Luego del período de incubación registrar los resultados (tubos con crecimiento ó sin crecimiento).

    Inhibición del crecimiento microbiano mediante el uso de sustancias antisépticas y desinfectantes

    Cada subgrupo contará con un cultivo líquido de uno de los siguientes microorganismos:

    a) Pseudomonas aeruginosa

    b) Escherichia coli

    c) Staphylococcus aureus

    d) Staphyloccus epidermidis

    Sembrar 0,1 ml de cada uno de los microorganismos en las placas que contienen agar nutritivo, dispersar el inóculo con espátula de Drigalsky esterilizada a la llama del mechero, dejar absorber el inóculo. Colocar con la ayuda de pinzas estériles (embebidas en alcohol y flameadas a la llama del mechero) discos de papel de filtro embebidos con diferentes sustancias antisépticas y desinfectantes. Incubar 24 – 48 h a 37ºC.

    Se usarán las siguientes sustancias antimicrobianas:

    1. Pervinox (Povidona - Iodo - Lauril éter - sulfato de sodio)

    2. Espadol (cloroxilenol)

    3. Mertiolate (timerosal)

    4. DG 6 (cloruro de lapirium)

    5. Ácido peracético

    6. Cetrimide (N-cetil-N,N,N-trimetilamonio bromuro)

    7. Cristal violeta

    8. Azul de metileno

    9. Hipoclorito de sodio al 1%

    10. Alcohol etílico al 70%

    Determinación de la CIM y de la CBM de un desinfectante y/o antiséptico

    Se usará un inóculo de Pseudomonas aeruginosa desarrollado en caldo nutritivo.

    Procedimiento:

    1. Realizar diluciones seriadas factor 2 de Pervinox en agua destilada: 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64; 1/128; 1/256; 1/512. Para ello colocar 1 ml de Pervinox al primer tubo de la serie que contiene 1 ml de agua destilada. Homogeneizar y sacar 1 ml de dicha suspensión y colocarlo en el segundo tubo de la serie, proceder de igual manera con los siguientes tubos hasta lograr la última dilución.

    2. Inocular cada uno de los tubos con caldo nutritivo con 1 ml del cultivo de P. aeruginosa (aproximadamente 106 cél/ml)

    3. Inocular cada uno de los tubos anteriores con 1 ml de cada dilución de Pervinox. Dejar actuar 15 minutos.

    4. Tomar 0,1 ml de cada una de las diluciones inoculadas anteriormente y extender con espátula de Drigalsky en placas de agar nutritivo (por duplicado). Incubar 24 – 48 h.

    5. Por otro lado, incubar también los tubos inoculados en el punto 3 durante 24 – 48 h.

    Segundo día

    • Determinar la presencia o ausencia de crecimiento en los diferentes microorganismos evaluados bajo diferentes condiciones de aw y pH.
    • Observar la inhibición del crecimiento microbiano por la acción de las distintas sustancias químicas, registrar el diámetro del halo de inhibición. Comparar la susceptibilidad de las cepas a los diferentes agentes químicos.
    • Determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) mediante la lectura de los tubos y la concentración bactericida mínima (CBM) de la lectura de las placas.
    • En cada uno de los casos formular conclusiones.

    Tratamiento de los materiales usados:

    • Una vez finalizado el trabajo de laboratorio, limpie adecuadamente las mesadas de trabajo con alcohol al 70% o hipoclorito de sodio al 1%.
    • Descarte todo material contaminado en las bolsas para residuos patógenos.
    • Lávese las manos con jabón.