18: Ingeniería Genética

La ingeniería genética es la manipulación deliberada del ADN, utilizando técnicas en el laboratorio para alterar genes en organismos. Incluso si los organismos que se alteran no son microbios, las sustancias y técnicas utilizadas a menudo se toman de microbios y se adaptan para su uso en organismos más complejos.

Pasos para clonar un gen

Caminemos por los pasos básicos para clonar un gen, proceso por el cual un gen de interés puede replicarse muchas veces. Pretendamos que vamos a diseñar genéticamente células de E. coli para que brillen en la oscuridad, característica que no poseen naturalmente.

1. Aislar el ADN de interés — primero necesitamos identificar los genes o genes que nos interesan, el ADN diana. Si queremos que nuestras células de E. coli brillen en la oscuridad, necesitamos encontrar un organismo que posea este rasgo e identificar el gen o genes responsables del rasgo. La proteína verde fluorescente (GFP) comúnmente utilizada como marcador de expresión en técnicas moleculares se aisló originalmente de medusas. En la clonación de un gen es útil utilizar un vector de clonación, típicamente un plásmido o virus, capaz de replicación independiente que portará de manera estable ADN objetivo de una ubicación a otra. Los vectores plasmídicos están disponibles tanto de bacterias como de levaduras.
2. Cortar el ADN con endonucleasas de restricción: una vez que se han identificado el ADN diana y el vector, ambos tipos de ADN se cortan usando endonucleasas de restricción. Estas enzimas reconocen secuencias cortas de ADN que tienen una longitud de 4-8 pb. Las enzimas están muy extendidas tanto en bacterias como en arqueas, reconociendo cada enzima una secuencia repetida invertida específica que es palindrómica (lee lo mismo en cada cadena de ADN, en la dirección 5' a 3').

   

   Endonucleasas de restricción.

   Mientras que algunas endonucleasas de restricción cortan directamente a través del ADN (es decir, corte romo), muchas hacen cortes escalonados, produciendo una región muy corta de ADN monocatenario en cada hebra. Estas regiones monocatenarias se denominan “extremos pegajosos” y son invaluables en la clonación molecular ya que las bases desapareadas se recombinarán con cualquier ADN que tenga la secuencia de bases complementaria.

3. Combinar ADN diana y vector — después de que ambos tipos de ADN hayan sido escindidos por la misma endonucleasa de restricción, los dos tipos de ADN se combinan junto con la adición de ADN ligasa, una enzima que repara los enlaces covalentes en la cadena principal de azúcar-fosfato del ADN. Esto da como resultado la creación de ADN recombinante, moléculas de ADN que contienen el ADN de dos o más fuentes, también conocidas como quimeras.

   

   Ligadura.

4. Introducir la molécula recombinada en la célula huésped: una vez que el ADN diana se ha combinado de manera estable con el ADN vector, el ADN recombinante debe introducirse en una célula hospedadora, para que los genes se repliquen o expresen. Existen diferentes métodos para introducir el ADN recombinante, dependiendo en gran medida de la complejidad del organismo huésped. En el caso de las bacterias, la transformación suele ser el método más fácil, utilizando células competentes para recoger las moléculas de ADN recombinante. Alternativamente, se puede usar la electroporación, donde las células se exponen a un breve pulso de electricidad de alto voltaje que hace que la membrana plasmática se vuelva temporalmente permeable al paso del ADN. Mientras que algunas células adquirirán ADN recombinante con la configuración apropiada (es decir, ADN diana combinado con ADN vector), el método también dará células portadoras de ADN recombinante con combinaciones alternas de ADN (es decir, ADN plasmídico que se combina con otra molécula de ADN plasmídico o ADN diana unido a más ADN diana). La mezcla se denomina biblioteca genómica y se debe cribar para seleccionar el clon apropiado. Si originalmente se usaron fragmentos aleatorios de ADN (en lugar del aislamiento de los genes de ADN diana apropiados), el proceso se conoce como clonación de escopeta y puede producir miles o decenas de miles de clones para ser cribados.

Introducir ADN recombinante en células distintas de bacterias

Agrobacterium tumefaciens y el plásmido Ti

Plasmido Inductor de Tumor.

Agrobacterium tumefaciens es un patógeno vegetal que causa la formación de tumores llamados enfermedad de la hiel coronario. La bacteria contiene un plásmido conocido como el plásmido Ti (inductor de tumores), que inserta ADN bacteriano en el genoma de la planta huésped. Los científicos utilizan este proceso natural para realizar ingeniería genética de plantas mediante la inserción de ADN extraño en el plásmido Ti y la eliminación de los genes necesarios para la enfermedad, permitiendo la producción de plantas transgénicas.

Pistola Gene

Una pistola genética utiliza partículas metálicas muy pequeñas (microproyectiles) recubiertas con el ADN recombinante, las cuales son voladas en tejido vegetal o animal a alta velocidad. Si el ADN es transformado o captado por el ADN de la célula, los genes se expresan.

Vectores virales

Para un vector viral, los genes de virulencia de un virus pueden eliminarse e insertarse ADN extraño, lo que permite que la cápside del virus se use como mecanismo para transportar material genético a una célula vegetal o animal. Generalmente se agregan genes marcadores que permiten la identificación de las células que tomaron los genes.

Técnicas de ADN

Electroforesis en Gel

La electroforesis en gel es una técnica comúnmente utilizada para separar fragmentos de ácido nucleico en función del tamaño. Se puede utilizar para identificar fragmentos particulares o para verificar que una técnica fue exitosa.

Se prepara un gel poroso hecho de agarosa, con la concentración ajustada en función del tamaño esperado. Las muestras de ácido nucleico se depositan en los pocillos del gel y se aplica una corriente eléctrica. El ácido nucleico, con su carga negativa, se moverá hacia el electrodo positivo, que deberá colocarse en la parte inferior del gel. El ácido nucleico se moverá a través del gel, con las piezas más pequeñas encontrando la menor resistencia y moviéndose así a través de las más rápidas. La longitud de paso de cada fragmento de ácido nucleico puede compararse con una escalera de ADN, con fragmentos de tamaño conocido.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un método utilizado para copiar o amplificar el ADN in vitro. El proceso puede producir mil millones de copias de un solo gen en un corto período de tiempo. El ADN molde se mezcla con todos los ingredientes necesarios para hacer copias de ADN: cebadores (pequeños oligonucleótidos que flanquean el gen o genes de interés al reconocer secuencias a cada lado del mismo), nucleótidos (los bloques de construcción del ADN) y ADN polimerasa . Los pasos implican calentar el ADN molde para desnaturalizar o separar las cadenas, bajar la temperatura para permitir que los cebadores se hibriden, y luego calentar la mezcla para permitir que la ADN polimerasa extienda los cebadores, utilizando el ADN original como inicial plantilla. El ciclo se repite 20-30 veces, aumentando exponencialmente la cantidad de ADN diana en pocas horas.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por Enzoklop (Obra propia) [CC BY-SA 3.0], vía Wikimedia Commons

Usos de organismos genéticamente modificados

Pueden existir numerosas razones para crear un organismo genéticamente modificado (OGM) u organismo transgénico, definido como un organismo genéticamente modificado que contiene un gen de un organismo diferente. Normalmente la esperanza es que el OMG proporcione la información necesaria o un producto de valor a la sociedad.

Fuente de ADN

Los organismos genéticamente modificados se pueden hacer para que una pieza de ADN pueda replicarse fácilmente, proporcionando una gran fuente de ese ADN. Por ejemplo, un gen asociado al cáncer de mama puede ser empalmado en el genoma de E. coli, permitiendo la rápida producción del gen para que pueda ser secuenciado, estudiado y manipulado, sin requerir donaciones repetidas de tejido de voluntarios humanos.

Fuente de ARN

El ARN antisentido es ARN monocatenario que es complementario al ARNm que codificará una proteína. En las células se hace como una forma de controlar genes diana. Ha habido un interés creciente en el uso del ARN antisentido como una forma de prevenir enfermedades que son causadas por la producción de una proteína en particular.

ARN antisentido. Por Robinson R [CC BY 2.5], vía Wikimedia Commons

Fuente de Proteína

Dado que los microbios se replican tan rápidamente, puede ser extremadamente ventajoso usarlos para fabricar proteínas de interés o valor. Dados los promotores adecuados, las bacterias expresarán genes para proteínas que no se encuentran de forma natural en las bacterias, como la citocina. Las células genéticamente modificadas se han utilizado para producir una amplia variedad de proteínas de uso para los humanos, como la insulina o la hormona del crecimiento humana.

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Preguntas de Estudio

1. Definir ingeniería genética.
2. Identificar y describir los pasos básicos utilizados en la ingeniería genética de una célula bacteriana. ¿Qué componentes se necesitan y por qué?
3. Resumir las diferentes formas en que el ADN recombinante puede insertarse en una célula u organismo. Ser capaz de proporcionar ejemplos específicos.
4. Describir las técnicas utilizadas en la manipulación del ADN. ¿Cuáles son los componentes esenciales de cada proceso?
5. Explicar las diferentes aplicaciones de la ingeniería genética.