2.4: Propiedades de la sangre como tampón y glucosa en sangre

Parte I: Homeostasis del pH de la sangre

La acidez y alcalinidad describen una propiedad de los químicos basada en la concentración relativa de iones de hidrógeno en una solución. La escala de pH mide este valor y oscila entre 0 y 14. Un pH de 7.0 se considera neutro. Un valor de pH mayor a 7 es básico, y un pH menor a 7.0 es ácido.

La escala de pH se define como el log negativo de la concentración de iones hidrógeno de una solución (figura 1). Esto significa que cada valor de pH en la escala representa una diferencia de diez veces en la molaridad de iones de hidrógeno que el siguiente valor. Por ejemplo, una solución con pH de 8.0 es cien veces más básica que una solución con un pH de 6.0. De igual manera, una solución con un pH de 5.0 es diez veces más ácida que una solución con un pH de 6.0.

Figura 1. Escala de pH que muestra concentraciones relativas de iones hidrógeno. Ejemplos de soluciones con su pH listado, y concentración de iones de hidrógeno en comparación con el agua destilada. A modo de comparación, otras soluciones biológicamente relevantes incluyen el pH del jugo pancreático, que es 8.8, y el líquido seminal, que tiene un pH de 7.8. Por ChMeD DL (Escala de pH)/CC-BY-SA.

En los sistemas biológicos, es importante mantener el pH de una solución dentro de un estrecho rango de valores. Para lograr esto, se utilizan búferes. Los tampones resisten los cambios en el pH de una solución cuando se agregan (o eliminan) iones de hidrógeno o hidróxido. Los tampones se disocian en solución y neutralizan los iones hidrógeno adicionales o iones hidróxido al participar en reacciones con ellos.

El pH normal de la sangre es 7.4, y el pH arterial solo puede variar entre 7.35 y 7.45 sin ser patológico. El sistema tampón de ácido carbónico-bicarbonato es el tampón más importante para mantener la homeostasis del pH de la sangre. En este sistema, el dióxido de carbono de desecho metabólico gaseoso reacciona con el agua para formar ácido carbónico, que se disocia rápidamente en un ion hidrógeno y bicarbonato (ver más abajo).

CO ₂ + H ₂ O H ₂ CO ₃ H+ + HCO ₃ —

Además del sistema de tampón de ácido carbónico-bicarbonato, existen otros tampones en la sangre completa, incluido el sistema de tampón fosfato. Adicionalmente, algunas proteínas tienen capacidad amortiguadora, como la hemoglobina y la albúmina sérica sanguínea (una proteína portadora común en la sangre). Estos tienen un efecto menor que el sistema de ácido carbónico-bicarbonato en el mantenimiento de la homeostasis del pH sanguíneo.

En la actividad de esta semana, probarás si cinco soluciones se comportan como buffers:

• Solución salina (una solución de agua salada)
• Solución salina tamponada con fosfato (PBS), que es una solución de hidrogenofosfato disódico, cloruro de sodio y cloruro de potasio de uso común en el laboratorio
• 5% de albúmina sérica sanguínea (una proteína que se encuentra en el suero sanguíneo)
• Plasma Sanguíneo (Oveja), diluido 10X con PBS (la parte líquida de la sangre, que contiene toda el agua, iones y proteínas menos cualquier elemento formado)
• Sangre Completa (Oveja) diluida 10X con PBS (que contiene todos los componentes de la sangre “viva”, incluidas las células)

Parte II: Homeostasis de Glucosa en Sangre

La homeostasis del azúcar en la sangre es importante 1.) para proporcionar de manera consistente a las células del cuerpo la glucosa necesaria para sostener las reacciones metabólicas y 2.) para proteger a las células contra el daño que puede ocurrir cuando los niveles circulantes de glucosa en sangre son demasiado altos durante demasiado tiempo. Para individuos sanos, la Asociación Americana de Diabetes recomienda un nivel de glucosa plasmática en ayunas (sin comida ni bebida, excepto agua, durante 8 horas) de menos de 100 mg/dL y, 2 horas después de las comidas, una concentración menor a 140 mg/dL.

Para controlar estrechamente los niveles de glucosa en sangre, las células α y β del páncreas endocrino secretan dos hormonas: la insulina y el glucagón. Al comer una comida, el aumento en el azúcar en la sangre es detectado directamente por los receptores en las células β de los islotes pancreáticos. Estas células luego secretan insulina, que se une a los receptores de insulina en varios tejidos corporales. Los receptores de insulina ocupados señalan a las células del cuerpo para aumentar el número de transportadores de glucosa, proteínas especiales que derivan la glucosa de la sangre, a través de las membranas plasmáticas celulares y hacia la célula. El aumento de los transportadores da como resultado una rápida internalización de la glucosa en sangre por las células.

Cuando los niveles de glucosa en sangre son demasiado bajos, por ejemplo, menos de 70 mg/dL o menos, el cuerpo puede no tener suficiente glucosa en sangre circulante para sostener las reacciones químicas del cuerpo. Los síntomas de un nivel bajo de azúcar en la sangre (hipoglucemia) pueden ser graves e incluyen: nerviosismo, temblores, fatiga, visión borrosa, dificultad para pensar e incluso la pérdida del conocimiento.

El nivel bajo de azúcar en la sangre es detectado por las células α- del páncreas, que aumentan la secreción de glucagón. El glucagón activa las enzimas hepáticas, que luego convierten la molécula de almacenamiento de glucosa, el glucógeno, en glucosa. El glucagón también inicia la síntesis endógena de glucosa a partir de otras biomoléculas como los aminoácidos. La glucosa recién liberada o sintetizada pasa al torrente sanguíneo y eleva los niveles de glucosa en sangre.

La diabetes es una afección en la que el cuerpo no responde a la insulina, lo que resulta en la incapacidad del cuerpo para controlar la homeostasis de la glucosa. Por lo general, en la diabetes tipo I, las células β pancreáticas son destruidas por una reacción autoinmune que resulta en insulina baja o ausente en el cuerpo. La diabetes tipo II también se llama “resistencia a la insulina”. Generalmente, en esta enfermedad, el organismo fabrica insulina, pero existe un problema que impide que los receptores de insulina envíen señales que incrementan la presencia de transportadores de glucosa en las membranas plasmáticas de las células.

En Lab esta semana, tu TA puede analizar tu Glucosa en Sangre usando un Sistema de Monitoreo de Glucosa en Sangre de Contorno. Se obtendrá una muestra de sangre del costado de su dedo medio o anular usando una Lanceta Accu-Chek Safe-T-Pro. Ofrece un pinchazo rápido, casi indoloro y solo se necesita una pequeña cantidad de sangre.

Figura cortesía de Anatomy & Physiology (Open + Free) CC BY-NC 4.0.

Métodos de Laboratorio

Ejercicios

En el siguiente texto se describen los métodos de laboratorio para el análisis de la amortiguación sanguínea y la glucosa en sangre.

En este experimento, los estudiantes determinarán las capacidades de tamponamiento de una variedad de soluciones midiendo el pH de las soluciones cuando son tratadas con una base débil. Cada grupo de estudiantes medirá los cambios de pH que ocurren en Solución Salina, Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS), Albúmina al 5% en PBS, Plasma Sanguíneo diluido 1/10 con PBS y Sangre Entera diluida 1/10 con PBS.

Objetivos de Laboratorio

• Los alumnos practicarán la técnica de pipeteado.
• Usaremos iWorx y calibraremos los electrodos con LabScribe.
• Los electrodos calibrados se utilizarán para determinar los cambios de pH que ocurren con la adición de NaOH a las soluciones de prueba.
• Analizar el cambio de pH para cada solución y determinar si se trata de un tampón.
• Finalmente, mediremos el nivel de glucosa en sangre de cada estudiante con un monitor de glucosa en sangre.

Equipo Requerido

• Computadora PC
• Unidad de adquisición de datos iWorx TA (IXTA)
• Electrodo de pH combinado ISE-100
• Salino
• PBS
• Albúmina al 5% en PBS
• 1/10 plasma sanguíneo en PBS
• 1/10 de sangre entera en PBS
• Vasos
• Pipeta 10-100μL o 20-100 μL
• Distilla d agua
• Kimwipes
• NaOH 0,1 M

Precauciones de Seguridad! Los estudiantes que trabajan con soluciones en este laboratorio deben usar guantes y guantes de seguridad.

Practica usando la micropipeta

Para extraer una cantidad específica de una solución, ajuste el dial de la micropipeta al volumen apropiado, luego presione el émbolo y sumerja la punta de la pipeta en la solución. El émbolo de la micropipeta tiene un primer tope “blando”. Cuando se empuja el émbolo hasta el primer tope, permite que la pipeta saque la cantidad programada ya que el émbolo se devuelve suavemente a la posición original. Para descargar la solución extraída, el émbolo se empuja hasta el segundo tope “duro”.

Para practicar, coloque una punta de plástico sobre la pipeta, empuje el émbolo hasta el primer tope, sumerja la punta de la pipeta en el agua destilada y permita suavemente que el émbolo regrese a su posición original. Mira la punta de plástico y nota cuánta agua destilada se ha tomado en la punta. Vuelva a descargar el agua destilada en el recipiente de agua destilada y repita. ¿Obtuviste la misma cantidad de agua destilada en la punta que la primera vez? Continúa practicando hasta que te sientas seguro de que estás operando la pipeta correctamente.

PARTE I. Configurar la computadora

• Encienda la Caja de Unidad iWorx en la Mesa de Laboratorio en el interruptor en la parte posterior de la caja. Asegúrese de que la Luz Verde esté encendida y que todo el equipo esté conectado a la caja de iWorx.
• Inicie sesión en la computadora usando su ID de ISU.
• Haga clic en el icono de carpeta en la barra de tareas inferior izquierda.
• Haga clic en “esta PC” en la barra de tareas del lado izquierdo.
• Haga doble clic en el P-Drive de materiales del curso Biol 256L en Ubicaciones de red.
• Haga doble clic en el archivo “Week3_BiologicalBuffers”.
• Haga clic en Aceptar a la Caja de Hardware Encontrado, si aparece.

Métodos figuras 1-3. El electrodo de pH ISE-100 y materiales asociados.

PARTE II: Calibrar el electrodo de pH

Nota: los electrodos son sensores delicados y caros, que pueden agrietarse fácilmente. No lo toque ni lo deje caer. Al colocarlo en un vaso de precipitados, hágalo con cuidado.

• Retire el electrodo de pH ISE-100 de su botella de tampón desenroscando un poco la tapa para que pueda sacar fácilmente el electrodo. Asegúrese de retirar la porción superior de la botella.
• Reemplace el tapón de rosca de la botella si está totalmente separado y vuelva a colocar en el vaso de precipitados de almacenamiento seco donde encontró el electrodo. Enjuague el electrodo con agua destilada mientras mantiene el electrodo sobre el vaso de precipitados grande utilizado para la recolección de líquidos de desecho.
• Coloque la punta del electrodo de pH ISE-100 en un pequeño vaso de precipitados que contenga suficiente agua destilada a temperatura ambiente para sumergir la punta. Mantener el electrodo en agua destilada por unos segundos.
• Obtener los tampones de calibración: Un vaso de precipitados contendrá tampón de pH 7 y el otro contendrá tampón de pH 10. Cada vaso de precipitados debe llenarse con suficiente tampón para cubrir la punta del electrodo de pH ISE-100, ¡pero NO MÁS es necesario!
• Retire el electrodo del agua destilada y seque suavemente cualquier gota extra de agua usando Kimwipes. Sumerja el extremo del electrodo en el vaso de precipitados de tampón pH 7.
• Haga clic en Grabar (el botón rojo en la barra de herramientas superior) en la ventana principal de LabScribe para comenzar a grabar. Después de unos segundos, el rastro alcanzará una línea base estable. Escriba pH 7 en el cuadro Marcar a la derecha del botón Marcar (en la parte superior central de la pantalla). Presiona la tecla Enter en el teclado para marcar la línea base estable de la grabación. Esto marcará la salida del electrodo de pH ISE-100 en tampón pH 7. Puede continuar grabando mientras cambia los vasos de precipitados de los búferes.
• Retire el electrodo de pH ISE-100 del vaso de precipitados de tampón pH 7. Sostenga el electrodo sobre el vaso de precipitados utilizado para recoger el líquido residual y enjuáguelo con agua destilada. Seque cualquier gota extra de agua con Kimwipe.
• Colocar el electrodo en el vaso de precipitados de tampón pH 10.
• A medida que continúe registrando, el rastro alcanzará una línea base estable, permitirá que se registre durante varios segundos. Escriba pH 10 en la caja Mark. Presiona la tecla Enter en el teclado para marcar la línea base estable de la grabación. Haga clic en Detener en la barra de herramientas LabScribe Main para detener la grabación
• Retire el electrodo del vaso de precipitados de tampón pH 10. Sostenga el electrodo sobre el vaso de precipitados utilizado para recoger el líquido residual y enjuáguelo con agua destilada de una botella de lavado. Seque cualquier gota extra de agua y coloque el electrodo en un vaso de precipitados limpio con agua destilada a temperatura ambiente.

Conversión de Unidades

• Desplácese hasta el inicio de los datos de calibración para el electrodo de pH ISE-100.
• Para mostrar los datos recopilados a pH 7 y pH 10 en la ventana Principal al mismo tiempo, puede usar el icono de Visualización de Doble Tiempo para ajustar el Tiempo de Visualización. Haga clic en Doble Tiempo varias veces hasta que su marca de pH 7 y la marca de pH 10 estén en la misma pantalla o el icono de Doble Cursor permitirá que aparezcan dos cursores rojos en la ventana Principal.
• Colocar un cursor rojo sobre una sección plana de datos recolectados cuando el electrodo de pH ISE-100 estaba en el tampón pH 7 y el segundo cursor rojo sobre una sección plana de datos recolectados cuando el electrodo estaba en el tampón pH 10.
• Haga clic en el icono Escala automática en la barra de herramientas encima de la pantalla del gráfico.

Métodos figura 4. Datos de calibración de pH registrados que muestran las posiciones de los cursores rojos para cambiar el voltaje registrado a valores de pH. Nota triángulo gris en círculo naranja.

• Para convertir los voltajes en las posiciones de los cursores a valores de pH, utilice la ventana de diálogo Conversión de Unidades Simples. Para acceder a esta ventana de diálogo, haga clic en la flecha gris (la esquina superior izquierda de la pantalla, ver círculo naranja en la figura 4, arriba) a la izquierda del título del canal, pH, para abrir el menú del canal.
• Seleccione Unidades en el menú del canal y seleccione Simple en el submenú Unidades.
• En la ventana Conversión de Unidades, (vea la imagen a continuación) asegúrese de seleccionar la calibración de 2 puntos en el menú desplegable en la esquina superior izquierda de la ventana.
• Ponga una marca de verificación en la casilla junto a Aplicar unidades a todos los bloques. Observe que los voltajes de las posiciones de los cursores se ingresan automáticamente en las ecuaciones de valores.
• Ingresa los dos búferes utilizados en el registro de calibración en los recuadros correspondientes del lado derecho de las ecuaciones de conversión. Ingresa el nombre de las unidades, pH, en el cuadro debajo de los valores del búfer.
• Haga clic en el botón Aceptar en la esquina inferior derecha de la ventana para activar la Conversión de Unidades.

Métodos figura 5. Ventana de diálogo de conversión de unidades simple que muestra los ajustes de conversión de unidades de

PARTE III: Prueba de los búferes potenciales

Importante: Haga clic en el icono del modo de cursor único para el resto de este experimento.

Soluciones para probar: Solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en PBS, plasma sanguíneo de oveja 10X en PBS, 10X sangre completa de oveja en PBS

Para cada solución a probar:

• Haga clic en el icono del modo de cursor único.
• Colocar aproximadamente 10ml de la solución de prueba en un vaso pequeño. Etiquete cada solución tampón con una etiqueta de papel removible que eliminará durante la limpieza al finalizar el laboratorio.
• Sumerja el electrodo en la solución de prueba y haga clic en Grabar. Espere unos minutos a que el pH se estabilice y marque este punto como Inicio para la Solución X (nombre la solución) presione ENTER.
• Añadir aproximadamente 50��L de NaOH a la solución de prueba. Agite suavemente la solución y espere unos segundos a que el pH se estabilice. Marcar este punto como 1 alícuota. Presione ENTER.
• Si el pH ha cambiado menos de 0.5 unidades, agregue otros 50��L de NaOH y marque 2 alícuotas y presione INTRO una vez que la solución se haya estabilizado. Continuar añadiendo 50��L de NaOH y marcando hasta que observe un cambio de 0.5 unidades o mayor. Deje de agregar NaOH si ha agregado 15 alícuotas de 50��L sin un cambio en el pH de al menos 0.5 unidades.
• En la Tabla de Datos 3.1 de su Informe de Laboratorio, registre el número de alícuotas de 50��L de NaOH requeridas para hacer que el pH suba al menos 0.5 unidades de pH. Si no observó ningún cambio en el pH después de agregar 15 alícuotas, anote “15+” en la tabla de datos.
• Repita el procedimiento con las otras soluciones de prueba asegurándose de enjuagar el electrodo con agua destilada limpia y secarlo con un Kimwipe limpio entre soluciones.
• Una vez que hayas probado todas las soluciones de prueba, vuelve a enjuagar el electrodo con agua destilada y secarlo con un Kimwipe. Inserte suavemente el electrodo en su botella original de tampón y enrosque suavemente la tapa. ¡Asegúrese de que el electrodo esté sumergido en el búfer y permanezca en posición vertical! Si el electrodo se seca, el equipo se dañará. Por favor vea la siguiente figura.
• Finaliza la Hoja de Trabajo de Propiedades de la Sangre Semana 3.
• Nota: Debido a que el plasma y la sangre completa se diluyen diez veces, su capacidad de amortiguación también se diluye. Por lo tanto, supongamos que estos fueron diez veces menos efectivos que si se utilizara plasma o sangre sin diluir.

Limpieza de laboratorio

Cuando la parte tampón del laboratorio esté completa, retire las etiquetas pequeñas de los vasos de precipitados y colóquelas en la basura. Levanta los vasos varias veces con agua y devuélvalos a sus lugares originales para que se sequen. Por favor, deje el electrodo en las mismas condiciones que se encontró: coloque el electrodo de nuevo en su pequeño vaso de precipitados con la tapa puesta (por favor asegúrese de que la solución tampón esté en el recipiente porque los electrodos no deben secarse), y coloque la botella de almacenamiento de electrodos en posición vertical dentro de una mayor vaso de precipitados.

Prueba de glucosa en sangre

Cuando se haya completado el trabajo de búfer en laboratorio, los TA ofrecerán a los estudiantes la oportunidad de participar en una prueba de glucosa en sangre. Los estudiantes registrarán su última comida y valor de glucosa en sangre en el reporte del laboratorio; sin embargo, esta parte del laboratorio es solo voluntaria, ya que los estudiantes deben extraer sangre. Las TAs podrán ofrecer un punto extra de crédito por participación en esta actividad. Los alumnos que decidan participar deberán firmar el formulario de consentimiento en el podio de TA.