28.6: Herramientas y Técnicas

Técnicas para estudiar las relaciones poblacionales

Existen varios métodos diferentes para estudiar las relaciones poblacionales con datos genéticos. El primer tipo de estudio general utiliza datos tanto de filogenia como de migración. Ajusta las filogenias a valores de Fst, valores de heterocigosidad subpoblacional (pioneros por Cavalli-Sforza y Edwards en 1967 [? ]). Este método también hace uso de mapas sintéticos y Análisis de Componentes Principales. [2] La principal desventaja de analizar los datos de población de esta manera es la incertidumbre sobre los resultados. Hay efectos matemáticos y de borde en el procesamiento de datos que no se pueden predecir. Además, ciertos grupos han demostrado que poblaciones mezcladas separadas y delimitadas pueden producir componentes principales de apariencia significativa por casualidad. Aunque los resultados del estudio sean correctos, entonces, también son inciertos.

El segundo método para analizar las relaciones entre subpoblaciones es el agrupamiento genético. Los clústeres se pueden formar usando ascendencia autodefinida [1] o la base de datos ESTRUCTURA. [3] Este método se utiliza en exceso y puede sobreajustar los datos; la composición de la base de datos puede sesgar los resultados de agrupamiento.

Los avances tecnológicos y el aumento de la recolección de datos, sin embargo, han producido conjuntos de datos que son 10,000 veces más grandes que antes, lo que significa que las afirmaciones más específicas pueden ser desestimadas por algún subconjunto de datos. Entonces, en efecto, muchos modelos que se predicen ya sea por filogenia y migración o agrupamiento genético serán desacreditados en algún momento, conduciendo a una confusión de resultados a gran escala. Una solución a este problema es utilizar un modelo sencillo que haga una afirmación que sea a la vez útil y que tenga menos probabilidad de ser falsificada.

Extracción de ADN de Huesos Neandertales

Echemos un vistazo a cómo vas a encontrar y secuenciar ADN de restos antiguos. Primero, hay que obtener una muestra de hueso con ADN de un Neandertal. El ADN humano y el ADN neandertal es muy similar (somos más parecidos a ellos que a los chimpancés), así que al secuenciar lecturas cortas con ADN muy antiguo, es imposible saber si el ADN es neandertal o humano. La cueva donde se encontraron los huesos se clasifica primero como humana o no humana utilizando basura o herramientas como identificador, lo que ayuda a predecir el origen de los huesos. Incluso si tienes un hueso, sigue siendo muy poco probable que tengas algún ADN recuperable. De hecho, el 99% de la secuencia de neandertales proviene de solo tres huesos largos encontrados en un sitio: la cueva Vindija en Croacia (5.3 Gb, 1.3x cobertura completa).

A continuación, el ADN se envía a un laboratorio de ADN antiguo. Ya que son huesos de 40 mil años, les queda muy poco ADN. Entonces, primero se les hace un cribado de ADN. Si encuentran ADN, la siguiente pregunta es si es ADN de primate. Por lo general, es ADN de microbios y hongos que viven en el suelo y digieren organismos muertos. Solo alrededor del 1-10% del ADN en huesos viejos es el ADN de los primates. Si es ADN de primates, ¿es contaminación del ser humano (arqueólogo o técnico de laboratorio) que lo maneja? Solo uno de los 600 pb es dierente entre humanos y ADN de neandertales. El tamaño de las lecturas de una muestra ósea de 40 mil años de edad es de 30-40 pb. Las lecturas son casi siempre idénticas para un humano y un neandertal, por lo que es difícil distinguirlas.

En una instancia, 89 extractos de ADN fueron cribados para ADN de neandertales, pero solo 6 huesos fueron realmente secuenciados (requiere falta de contaminación y cantidad suficientemente alta de ADN). El proceso de recuperación del ADN requiere perforar debajo de la superficie ósea (para minimizar la contaminación) y tomar muestras desde adentro. Para los tres huesos largos, se pudo obtener menos de 1 gramo de polvo de hueso. Luego se secuencia el ADN y se alinea con un genoma de chimpancé de referencia. Se mapea a un chimpancé en lugar de a un humano en particular porque mapear a un humano podría causar sesgo si se busca ver cómo se relaciona la secuencia con subpoblaciones humanas específicas.

Los hallazgos más exitosos han sido en cuevas frías de piedra caliza, donde es seca y fría y quizás un poco básica. La mejor probabilidad de conservación ocurre en áreas de permafrost. Muy poco ADN es recuperable de los trópicos. Los trópicos tienen un gran registro fósil, pero el ADN es mucho más difícil de obtener. Dado que la mayoría de los huesos no producen suficiente o buen ADN, los científicos tienen las muestras de cribado una y otra vez hasta que finalmente encuentran una buena.

Reensamblar ADN antiguo

El ADN extraído de los huesos neandertales tiene lecturas cortas, alrededor de 37 pb en promedio. Hay muchos agujeros debido a mutaciones causadas por el tiempo erosionando el ADN. Es difícil saber si una secuencia es el resultado de la contaminación porque los humanos y los neandertales sólo difieren en una de cada mil bases. Sin embargo, podemos usar el daño del ADN característico del ADN antiguo para distinguir el ADN antiguo y el nuevo. El ADN antiguo tiene una tendencia hacia los errores C a T y G a A. El error C a T es con mucho el más común, y se ve alrededor del 2% de las veces. Con el tiempo, un grupo metilo se desprende de una C, lo que hace que se asemeje a U. Cuando se usa PCR para amplificar el ADN para secuenciación, la polimerasa ve una U y la repara a una T. Para combatir este error, los científicos utilizan una enzima especial que reconoce la U, y corta la hebra en lugar de reemplazarla con una T. Esto ayuda a identificar esos sitios. Las mutaciones G a A son el resultado de verlo en la hebra opuesta.

El tamaño promedio del fragmento es bastante pequeño, y la tasa de error sigue siendo 0.1% - 0.3%. Una forma de combatir las mutaciones es notar que en un fragmento bicatenario, el ADN se deshilacha hacia los extremos, donde se vuelve monocatenario durante aproximadamente 10 pb. Suelen haber altas tasas de mutaciones en las primeras y últimas 10 bases, pero ADN de alta calidad en otros lugares, es decir, más mutaciones C a T al principio y G a A al final. En los chimpancés, las mutaciones más comunes son las transiciones (purina a purina, pirimidina a pirimidina), y las transversiones son mucho más raras. Lo mismo ocurre con los humanos. Dado que las mutaciones G a A y C a T son transiciones, se puede determinar que hay aproximadamente 4 veces más mutaciones en el ADN neandertal antiguo que si fuera fresco al anotar el número de transiciones vistas en comparación con el número de transversiones observadas (comparando el ADN de Neandertal con el ADN humano). Las transversiones tienen una tasa de ocurrencia bastante estable, por lo que esa relación ayuda a determinar cuánto error ha ocurrido a través de mutaciones C a T.

Ahora somos capaces de reducir la contaminación humana del ADN del artefacto\(\text{i} 1 \%\). Cuando se introduce el ADN, tan pronto como se extrae del hueso se codifica con barras con una etiqueta de 7 pb. Esa etiqueta permite evitar la contaminación en cualquier momento posterior del experimento, pero no antes. La extracción también se realiza en una sala limpia con luz UV, después de haber lavado el hueso. El ADN mitocondrial es útil para distinguir qué porcentaje de la muestra está contaminada con ADN humano. El ADN mitocondrial está lleno de sitios de eventos característicos porque los humanos y los neandertales son recíprocamente monofilogenéticos. La contaminación se puede medir contando la proporción de esos sitios. En el ADN neandertal, la contaminación estaba presente, pero sí\(\text { ¡ } 0.5 \%\).

En la secuenciación, la tasa de error es casi siempre mayor que la tasa de polimorfismo. Por lo tanto, la mayoría de los sitios en la secuencia que son diferentes a los humanos son causados por errores de secuenciación. Entonces no podemos aprender exactamente sobre la biología neandertal a través de la secuencia generada, pero podemos analizar SNP particulares siempre y cuando sepamos dónde buscar. La probabilidad de que un SNP en particular sea cambiado debido a un error en la secuenciación es solo\(\frac{1}{300}\) de 11000, por lo que aún se pueden obtener datos utilizables.

Después de alinear las secuencias de chimpancés, neandertales y humanos modernos, podemos medir la distancia entre los neandertales y los humanos y los chimpancés. Esta distancia es sólo de aproximadamente 12.7% de la secuencia de referencia humana. Una muestra francesa mide aproximadamente 8% de distancia de la secuencia de referencia, y una bosquimana aproximadamente 10.3%. Lo que esto dice es que el ADN neandertal está dentro de nuestro rango de variación como especie.