16.3: Restricción In Silico
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Las enzimas de restricción actúan como tijeras moleculares. Los que usamos en Biología Molecular son aquellos que cortan dentro de secuencias conocidas que ocurren con la frecuencia suficiente, pero lo suficientemente raras como para cortar nuestro ADN en fragmentos analizables. Los biólogos moleculares suelen utilizar 6 cortadores. Esto significa que el sitio de digestión está “restringido” a una secuencia de reconocimiento de 6 nucleótidos. Estos nucleótidos suelen ser palindrómicos como se discutió anteriormente.
Imagina una pieza lineal de ADN como un trozo de cuerda. Al cortar la cuerda una vez, resulta en 2 piezas. Consideremos ahora un plásmido. Esto ya se discutió para ser una pieza circular de ADN. Con un círculo, no hay extremos. Cortar el plásmido una vez da como resultado 1 pieza de ADN en lugar de 2. Tenga esto en cuenta a la hora de digerir plásmidos circulares. En este caso, el nucleótido 1 es adyacente y contiguo al último nucleótido de la secuencia.
Digestión In Silico
- Esta actividad está destinada a complementar Identificación de ADN (actividad)
- Lanza UGENE y abre los siguientes archivos:
- En el menú Objetos, haga clic con el botón derecho en las secuencias y seleccione “Marcar como circular”
- Las secuencias ahora serán tratadas como ADN circular.
- El primer nucleótido y el último nucleótido se vuelven adyacentes como una secuencia continua de esta manera.
4. En el menú superior, seleccione Acciones → Analizar → Buscar sitios de restricción.
- Esto cargará un conjunto de enzimas de restricción predeterminadas
- Si no hay ninguna carga, selecciónelas individualmente (se encuentran en orden alfabético)
- Elija: BamHi, BglII, ClaI, DraI, EcoRI, EcoRV, HindIII, KpnI, PSTi, SalI, SmaI, XbaI, XmaI, NotI
5. Acciones → Clonación → Digerir en fragmentos
- Elige tu enzima.
- Prueba Hind III para cada plásmido.
- Los fragmentos se agregarán a la vista circular y se agregarán anotaciones para estos fragmentos.
- Puede utilizar esta información para calcular cuántos fragmentos provienen de enzimas en función de cuántas veces cortan y por las coordenadas nucleotídicas que se encuentran en la anotación del fragmento.