1.8: Expresión Génica- Ejemplo Aplicado (Parte 2)
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Al finalizar esta lección deberías ser capaz de...
- Explicar cómo una mutación en un solo gen puede controlar la resistencia a herbicidas como los inhibidores de la ELA.
- Predecir el impacto de una mutación específica en la expresión génica y el rasgo eventual observado en una planta.
- Distinguir entre las definiciones moleculares y clásicas de un alelo.
- Describir las bases moleculares de la dominancia o la falta de dominancia entre alelos.
Esta lección describe cómo los cambios en la secuencia de ADN de un gen pueden alterar la síntesis de una proteína y así influir en rasgos como la resistencia a herbicidas. En esta lección describiremos cómo los cambios en el gen pueden alterar el proceso de expresión génica e influir en los rasgos de un organismo. El ejemplo específico de resistencia a herbicidas inhibidores de la ALS se utiliza para demostrar el impacto del cambio genético en la expresión de rasgos en una planta.
La secuencia determina la estructura, la estructura determina la función
La transcripción y traducción son fundamentales para la producción de todas las proteínas que se encuentran en todos los seres vivos. Es por ello que descubrir la secuencia de un gen puede permitir a los genetistas predecir la secuencia de aminoácidos de la proteína que codifica el gen. Recuerde, una proteína completamente sintetizada tendrá cientos de aminoácidos de longitud y así un gen promedio tendrá dos o tres mil nucleótidos en su secuencia. A medida que se aprende más sobre cómo la secuencia de aminoácidos dicta la función de las proteínas, aumenta el valor de la información de la secuencia génica para los biólogos. En esta lección, aplicaremos nuestra comprensión del proceso de expresión génica para comprender la base genética de la resistencia a los herbicidas ALS en plantas.
La enzima ALS es de aproximadamente 800 aminoácidos. El orden específico de aminoácidos en la cadena proteica dicta cómo se puede plegar la molécula en una estructura secundaria (Fig. 1). [1] Esto se debe a que cada aminoácido tiene una química diferente que influye en su interacción con otros aminoácidos dentro de la cadena proteica. La estructura secundaria de la proteína determina la función de la proteína. Podemos relacionar este principio con objetos funcionales que nos son más familiares. ¿Por qué alguien necesitaría un juego de llaves? Cada herramienta del conjunto está hecha de los mismos materiales. Sin embargo, la forma y dimensiones específicas de cada herramienta le permiten realizar una función específica. La enzima ALS funciona catalizando reacciones para la síntesis de aminoácidos en el cloroplasto en una célula vegetal. Por lo tanto, la estructura de la enzima ALS de la planta indica a la célula que transporte la enzima al cloroplasto y luego permite que la enzima catalice la formación de un enlace entre las moléculas precursoras de aminoácidos. Claramente era importante ensamblar los aminoácidos correctamente al construir la enzima ALS para permitir que funcionara correctamente.
ALS y control de malezas
La función de la enzima ALS en las plantas también es un tema interesante en el área del control de malezas. Se han descubierto herbicidas con químicas de sulfonilurea o imidazolinona que se unirán a las enzimas ALS en las plantas e interrumpirán sus funciones catalíticas (Figura 2). Debido a que los herbicidas se unen fuertemente a la ELA y la ELA no se encuentra en copias altas en la célula, los herbicidas detendrán efectivamente la síntesis de los aminoácidos Leucina, Isoleucina y Valina (Leu, Ile, Val). ¿Cómo responderán las plantas ante el desabasto de estos tres aminoácidos? Dejan de crecer porque no pueden producir tres de los veinte aminoácidos.
Las proteínas que necesitan estos aminoácidos serán sintetizadas sólo parcialmente. Las proteínas parciales no funcionarán porque carecen de la estructura necesaria para su función. Las células vegetales no pueden crecer y dividirse y el crecimiento y desarrollo de la planta se detienen. No necesariamente morirán pero ya no podrán competir por la luz y otros recursos si las plantas cercanas no se ven afectadas por los inhibidores de la ELA. Si la planta cercana que no se ve afectada por los inhibidores de la ELA es una especie de cultivo como el maíz o la soya, se puede implementar una valiosa estrategia de control de malezas post emergencia.
ALELOS ALELOS
El control de malezas post emergencia por inhibidores de ELA funciona en genotipos de maíz y soja con genes ALS alterados. Los genes alterados codifican una enzima ALS ligeramente modificada que es resistente a los inhibidores de la ELA. Se puede determinar la base molecular de esta alteración y ayudarnos a entender qué son los alelos de un gen. Incluso sin análisis molecular, los genetistas descubrieron alelos del gen ALS que harían a las plantas resistentes a los herbicidas ALS. ¿Cómo se descubrieron estos alelos?
Los criadores de maíz sabían que la resistencia a la ELA no se producía naturalmente en sus líneas de reproducción. Este descubrimiento fue fácil de hacer. Plantaron miles de líneas diferentes en hileras cortas en el campo, rociaron el campo con el herbicida y observaron la reacción de las líneas. Todas las líneas ensayadas tuvieron retraso en el crecimiento significativo. La variación no existía en sus líneas por lo que decidieron intentar inducir la variación por mutagénesis. El polen se colectó de plantas que habían sido expuestas a un mutágeno químico. La química indujo errores en la replicación del ADN durante la formación de polen. El polen era viable pero portaba alelos mutantes. Este polen se aplicó a las sedas de otras plantas de maíz para producir miles de semillas. Esta semilla se sembró y se repitió la prueba de campo para resistencia a la ELA. Esta vez se observaron algunas plantas resistentes al retraso del crecimiento por ELA, etiquetadas y autopolinizadas. A partir de este experimento, se descubrió el alelo IT (immi tolerante). El alelo IT pareció ser dominante sobre el alelo ALS normal porque las plantas con una copia del alelo IT por célula (heterocigotos) tenían el mismo nivel de resistencia que las plantas que tenían dos copias del alelo IT (homocigotos). Se realizó un análisis molecular de estas plantas para revelar cómo el alelo IT fue diferente para la versión original.
El alelo de TI
El alelo IT del gen ALS tiene un cambio en la secuencia de la región codificante. Esto fue descubierto haciendo una genoteca a partir del ADN de plantas IT homocigóticas y seleccionando un clon del gen IT. El clon del gen se secuenció y se comparó con el gen ALS susceptible normal del maíz. Una sustitución de un solo nucleótido en el alelo IT fue la encargada de dotar a una planta de maíz con resistencia a herbicidas ALS. La sustitución de nucleótidos estuvo en la región codificante del gen por lo que cambió una secuencia de codón en el ARNm, codificando un aminoácido diferente en la proteína. La sustitución de aminoácidos tuvo un efecto menor o insignificante sobre la capacidad de la enzima para realizar sus funciones normales. Sin embargo, la sustitución de aminoácidos cambió el sitio en el que el herbicida ALS se une a la enzima. El herbicida ALS no interactuará con la enzima ALS codificada por el alelo IT, dando a la planta resistencia al herbicida. Este es un ejemplo de cómo un pequeño cambio en un gen puede tener un gran impacto en el fenotipo de una planta en el ambiente adecuado.
El alelo IR, Selección de Cultivo de Tejidos para Mutaciones
Los alelos ALS que confieren resistencia a herbicidas de immidazolinona también se han seleccionado de mutaciones que han ocurrido en células de cultivo tisular. La replicación del ADN no ocurre al 100 por ciento sin errores por lo que no es sorprendente que ocurran mutaciones naturales en las células. Sin embargo, una mutación que da a una sola célula en una planta de maíz resistencia a los herbicidas ALS no hará que toda la planta sea resistente. Los genetistas han utilizado el poder del cultivo de tejidos para seleccionar estas mutaciones a nivel de células individuales. Cientos de miles de células de maíz se pueden cultivar en placas de cultivo de tejidos que contienen el herbicida. La mayoría de las células dejarán de crecer y dividirse cuando tomen el herbicida pero algunas células continúan creciendo y formando grupos de células indiferenciadas llamadas callos. Las plantas regeneradas a partir de estas células de callo a menudo también expresarán la resistencia a herbicidas. De esta manera se seleccionó el alelo IR del gen ALS.
Este alelo también tiene una secuencia de región codificante alterada que bloquea la unión de los herbicidas ALS. La enzima ALS codificada por el alelo IR, sin embargo, no proporciona los niveles deseados de resistencia a herbicidas en una planta heterocigótica. Los mecanismos moleculares que causan esta diferencia en el IR en comparación con el alelo IT no están claros. La implicación de esta diferencia en el fitomejoramiento es significativa. El alelo IT se puede heredar de un solo progenitor para dar resistencia al herbicida híbrido 'Clearfield' o “Immi”. Los híbridos deben ser homocigotos para el alelo IR requiriendo que ambos progenitores sean endogóticos de IR homocigotos (Figura 3).
Bases Moleculares de Dominancia
La ocurrencia de los alelos IT, IR y normales de la enzima ALS y su impacto en el fenotipo vegetal nos brinda la oportunidad de pensar en la dominancia y la falta de dominancia a nivel molecular. El alelo IT tiene dominancia completa con respecto al alelo normal debido a que aparentemente no hay diferencia de fenotipo entre plantas IT homocigóticas dominantes y heterocigóticas cuando son rociadas con un inhibidor de la ELA. Esto sugiere que en las plantas heterocigóticas, una copia del alelo IT por célula codifica suficiente proteína ALS resistente para impulsar la síntesis de cantidades suficientes de Val, Leu e Ile para el crecimiento normal en la planta de maíz. Sin embargo, la enzima ALS codificada por el alelo normal en estos heterocigotos puede ser inhibida por el herbicida y no contribuirá a la síntesis de aminoácidos.
En contraste, el alelo IR presenta una falta de dominancia con respecto al alelo normal (IN). Las plantas heterocigóticas que tienen una copia del IR y una copia del alelo normal por célula no mantienen un crecimiento normal después del tratamiento con inhibidor de la ELA. Una copia del alelo IR por célula no codifica suficientes copias de una enzima ALS resistente para soportar el crecimiento normal. En cambio, se necesitan dos copias del alelo IR por célula para que toda la enzima ALS elaborada no quede unida por el herbicida.
La clasificación del fenotipo vegetal para caracterizar los posibles genotipos en el locus ALS puede depender del ambiente. En algunos ambientes de cultivo se ha observado que los híbridos IT heterocigotos mostrarán una ligera reducción del crecimiento en las plantas rociadas en comparación con las no pulverizadas. La diferencia es menor porque las plantas suelen crecer a partir de esta diferencia más adelante y la reducción del rendimiento no es un factor. Esta observación enfatiza que el fenotipo es resultado del genotipo y el ambiente. Por lo tanto, puntuar rasgos en el ambiente adecuado será fundamental para descubrir la naturaleza de la acción génica.
¿Qué tan universal es el Código Genético?
La tabla de codones utilizados por los organismos para traducir el ARNm en proteínas se muestra en la parte inferior de la página (Cuadro 1). Como se mencionó anteriormente en esta lección, el código genético necesitaba ser descifrado una vez porque todos los organismos usaban los mismos codones para codificar aminoácidos. A medida que los científicos comenzaron a secuenciar las regiones codificantes de genes de diferentes organismos, descubrieron algo llamado preferencia de codón. Cuando miras la tabla de codones, puedes ver que el código genético es redundante. Esto significa que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido. Esto se debe a que hay 61 codones que codifican para la colocación de 20 aminoácidos diferentes. Un codón solo funcionará en la codificación si un ARNt con un anticodón complementario también se encuentra en la misma célula y tiene el aminoácido apropiado para administrar. Por lo tanto, podría haber 61 ARNt diferentes, uno para complementar cada codón. Cada ARNt diferente necesita ser codificado por un gen diferente. Si ese gen no se expresa en la célula, no se encontrará el ARNt y no se complementará un codón que necesite complementarse con ese ARNt. En este caso, el codón actuará como un codón de parada. El ribosoma detendrá la traducción y la proteína producida será una versión más corta de la proteína pretendida. Los organismos no se beneficiarían de esta situación por lo que existe una estrecha complementación entre qué genes de ARNt están presentes y expresados en las células de un organismo y qué codones se utilizan para codificar un ARNm específico. De esta manera el código genético tendrá un dialecto. El lenguaje es universal pero ciertas palabras se utilizan preferencialmente.
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Primera posición |
Segunda Posición |
Tercera Posición |
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U |
C |
A |
G |
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U |
Phe (F) |
Ser (S) |
Tyr (Y) |
Cys (C) |
U |
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C |
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Leu (L) |
Detener |
Detener |
A |
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|
Detener |
Trp (W) |
G |
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C |
Leu (L) |
Pro (P) |
Su (H) |
Arg (R) |
U |
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C |
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Gln (Q) |
A |
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|
G |
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A |
Ile (I) |
Thr (T) |
Asn (N) |
Ser (S) |
U |
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C |
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Lys (K) |
Arg (R) |
A |
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M y (M) |
G |
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|
G |
Val (V) |
Ala (A) |
Asp (D) |
Gly (G) |
U |
|
C |
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Glu (E) |
A |
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|
G |
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Los científicos no están seguros de por qué las preferencias de codones son parte del proceso de expresión génica en los organismos. Puede proporcionar otro nivel para que el organismo controle las cantidades y tipos de proteínas elaboradas en sus células. Experiencias recientes en ingeniería genética de plantas y animales, sin embargo, han hecho de la preferencia de codones una consideración importante. Por ejemplo, los científicos han puesto genes de una bacteria del suelo llamada Bacillus thuringiensis (Bt) en células de plantas de maíz con el fin de darle a la planta de maíz la capacidad de producir una proteína que es tóxica para el barrenador europeo del maíz, una plaga común para los productores de maíz. Encontraron que el gen sería transcrito pero el ARNm no se traduciría para hacer la proteína deseada. Una razón fue el uso de codones. Algunos de los codones que las bacterias utilizan para codificar aminoácidos rara vez son utilizados por el maíz. La planta de maíz carecía del ARNt para complementar el codón o hacer el ARNt a niveles tan bajos que no había suficientes copias en la célula para acomodar la traducción del ARNm de Bt. Por lo tanto, los ingenieros genéticos necesitaron hacer regiones codificantes sintéticas que sustituyeran los codones preferidos por el maíz por los preferidos por las bacterias. El resultado final fue que pudieron obtener mayores niveles de la proteína Bt realizada una vez que se realizaron estos cambios en el gen. La preferencia de codones hace que el proceso de ingeniería genética sea más desafiante.
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- Los gráficos utilizados en esta figura fueron tomados de The RCSB PDB “Molecule of the Month”: Inspirando una visión molecular de la biología D.S. Goodsell, S. Dutta, C. Zardecki, M. Voigt, H.M. Berman, S.K. Burley (2015) PLoS Biol 13 (5): e1002140. doi: 10.1371/journal.pbio.1002140