8.5: Evidencia de heterodúplex a partir de recombinación en hongos

El mecanismo por el cual se produce la recombinación se ha estudiado principalmente en hongos, como la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae y el hongo filamentoso Ascomycetes, y en bacterias. Los hongos sufren meiosis, y por lo tanto algunos aspectos de sus sistemas de recombinación pueden ser más similares a los de plantas y animales que a los de las bacterias. Sin embargo, las funciones enzimáticas descubiertas por estudios genéticos y bioquímicos de recombinación en bacterias también están demostrando tener contrapartes en organismos eucariotas. Nos referiremos a estudios principalmente en hongos para los modelos de recombinación, y a estudios principalmente en bacterias para las vías enzimáticas.

Muchos conocimientos importantes sobre el mecanismo de recombinación provienen de estudios en hongos. Una observación fundamental es que la recombinación procede por la formación de una región de heterodúplex, es decir, los productos de recombinación tienen una región con una cadena de un cromosoma y la cadena complementaria del otro cromosoma. Así, la recombinación no es una operación simple de cortar y pegar, a diferencia de la unión de dos moléculas diferentes mediante tecnología de ADN recombinante. Las dos moléculas recombinantes se unen y forman un híbrido, o heterodúplex, en parte de sus longitudes.

La anatomía y fisiología del hongo filamentoso Ascomycetes permite observar este heterodúplex formado durante la recombinación. Una célula sometida a meiosis comienza con un complemento 4n de cromosomas (es decir, el doble del número diploide) y se somete a dos rondas de división celular para formar cuatro células haploides. En los hongos estas células germinales haploides son esporas, y se encuentran juntas en un ascus. Se pueden separar por disección y sembrar individualmente para examinar el fenotipo de los cuatro productos de la meiosis. A esto se le llama análisis de tétradas.

El hongo Ascomycetes va un paso más allá. Una vez completada la meiosis, las células germinales se someten a otra ronda de replicación y mitosis. Esto separa cada cadena de polinucleótido individual (o “cadena” en el sentido utilizado en la bioquímica de ácidos nucleicos) de cada dúplex de ADN en los productos meióticos en una espora separada. Las ocho esporas del ascus reflejan la composición genética de cada una de las ocho cadenas de polinucleótidos en los cuatro cromosomas homólogos. (Las dos cromátidas hermanas en cada cromosoma homólogo se convierten en dos cromosomas después de la meiosis, y cada cromosoma es un dúplex de dos cadenas de polinucleótidos).

El orden de las ocho esporas en el ascus de Ascomycetes refleja el descenso de las esporas de los cromosomas homólogos. Como se muestra en la Figura 8.5, un heterocigoto con un alelo “azul” en un cromosoma homólogo y un alelo “rojo” en el otro normalmente producirá cuatro esporas “azules” y cuatro esporas “rojas”. Las cuatro esporas con el mismo fenotipo se derivaron de un cromosoma homólogo y son adyacentes entre sí en el ascus. Esto se denomina relación parental 4:4, es decir, con respecto a los fenotipos del progenitor del heterocigoto.

La evidencia de formación de heterobúplex proviene de desviaciones de la relación normal 4:4. A veces se observa una proporción parental de 3:5 para un marcador genético en particular. Esto demuestra que una cadena de polinucleótido de un alelo se ha perdido (dando 4-1=3 esporas con el fenotipo correspondiente en el ascus) y se ha reemplazado por la cadena de polinucleótidos del otro alelo (dando 4+1=5 esporas con el fenotipo correspondiente). Como se ilustra en la Figura 8.5, se trata de 3 esporas azules y 5 esporas rojas. El segmento del cromosoma que contenía este gen fue un heterodúplex con una cadena de cada uno de los dos alelos. La ronda de replicación y mitosis que sigue a la meiosis en este hongo permite separar las dos cadenas en dos alelos que generaron un fenotipo diferente en un ensayo de siembra. Así, esta relación 3:5 resulta de la segregación post-meiótica de las dos cadenas de los diferentes alelos. En este hongo, se puede observar directamente una región de heterobúplex mediante un ensayo de siembra.

La región de heterobúplex se asocia con una recombinación entre los cromosomas. Otros genes flanquean la región de heterobúplex que se muestra en la Figura 8.5. En muchos casos, la disposición de los alelos de estos genes flanqueantes ha cambiado a partir de la de los cromosomas parentales, reflejando una recombinación. Por ejemplo, dejar que la región del heterodúplex esté en un gen B, flanqueado por el gen A a la izquierda y el gen C a la derecha. Cada gen tiene un alelo azul y un alelo rojo, haciendo los cromosomas parentales AbbbCB y ArbrCr. Si se monitorizaran los fenotipos de determinados por los genes A y C (además de B) en la tercera y cuarta esporas (derivadas del cromosoma con el heterodúplex), verían los fenotipos para los cromosomas no parentales abbbCr y AbBrCR. Este cambio en los marcadores flanqueantes (genes A y C) refleja una recombinación. Así, el heterobúplex se puede encontrar entre marcadores que han sufrido recombinación.

Otros marcadores pueden mostrar una proporción parental 2:6. Esto significa que uno de los alelos (anteriormente azul en la fig. 8.5) se ha cambiado por el otro alelo (ahora rojo), en un proceso llamado conversión génica. Esto puede ocurrir entre marcadores flanqueantes que han sido cambiados debido a la recombinación. Así, al igual que el heterobúplex, la región de conversión génica está asociada con la recombinación. Los modelos de recombinación necesitan incorporar ambos fenómenos en su mecanismo propuesto.

Figura 8.5. Las esporas formadas durante la meiosis en Ascomicetos reflejan la composición genética de las cadenas de ADN parentales. Los cuatro cromosomas homólogos en el estado 4n se muestran como moléculas de ADN dúplex, con una línea para cada cadena de ADN. Dos cromátidas hermanas son azules y dos cromátidas hermanas son rojas, lo que refleja su capacidad para distinguirse en un ensayo de placas para genes particulares a lo largo del cromosoma. La meiosis coloca cada uno de los cuatro cromosomas homólogos en una célula diferente, y en esta especie, va seguida de replicación y mitosis de manera que cada una de las ocho esporas (círculos en la elipse alargada que representan el ascus) tiene la composición genética de cada una de las ocho cadenas de ADN en las cuatro cromosomas que resultan de la meiosis (dos cadenas complementarias por cromosoma). Una región de heterodúplex puede verse como una relación parental 3:5 después de la segregación post-meiótica. Una región de conversión génica puede verse como una proporción parental 2:6.

Ejercicio 8.3.

Imagina que estás estudiando un hongo que genera un ascus con 8 esporas como Ascomycetes, en el que los productos de la meiosis completan una ronda adicional de replicación y mitosis. Se genera una cepa heterociótica al aparear un progenitor que era homocito para los marcadores leu+, SmR, ade8+ y otro que era leu-, sM, ade8-. Estudios previos habían demostrado que los tres marcadores están vinculados en el orden dado. Cada uno de estos pares de alelos se puede distinguir en un ensayo de siembra. El alelo leu+ confiere auxotrofia leucina mientras que leu- confiere prototrofia leucina. El alelo SmR confiere resistencia a la espectinomicina mientras que SMs es sensible a este antibiótico. Las colonias de hongos con el alelo ade8+ dan un color rojo en condiciones apropiadas en una placa, pero las que tienen el ade8- son blancas. El análisis de las esporas individuales de un ascus dio los siguientes resultados de fenotipos. Las esporas están numeradas en el orden en que estuvieron en el ascus. ¿Cuáles son los genotipos correspondientes del cromosoma en cada espora? ¿Cómo se interpretan estos resultados con respecto a la recombinación?

Espora	leucina	Espectinomicina	Prueba de color en ade
1	prototrofo	resistente	rojo
2	prototrofo	resistente	rojo
3	prototrofo	resistente	blanco
4	prototrofo	sensible	blanco
5	auxótrofo	sensible	rojo
6	auxótrofo	sensible	rojo
7	auxótrofo	sensible	blanco
8	auxótrofo	sensible	blanco