8.7: Modelo de doble hebra para recombinación

Varias líneas de evidencia, principalmente de estudios de recombinación en levaduras, requirieron cambios en el intercambio recíproco de cadenas de ADN iniciadas en mellas monocatenarias. Como se acaba de mencionar, un dúplex de ADN tendía a ser el donante de información y el otro el receptor, en contraste con el intercambio igualitario predicho por el modelo Holliday original. Además, en levaduras, la recombinación podría iniciarse por roturas bicatenarias. Por ejemplo, ambas cadenas de ADN se escinden (por la endonucleasa HO) para iniciar la recombinación entre los loci MAT y HML (R) en el cambio de tipo de apareamiento en levaduras. Usando plásmidos transformados en levadura, se demostró que un hueco bicatenario en el dúplex “agresor” podría usarse para iniciar la recombinación, y el hueco se reparó durante la recombinación (este experimento se explora en el problema 8.___). En este caso, el hueco en un dúplex se llenó con ADN donado del otro sustrato. Toda esta evidencia se incorporó a un importante nuevo modelo de recombinación de Jack Szostak y sus colegas en 1983. Se llama el modelo doble-strand-break. Las nuevas características de este modelo (contrastando con el modelo Holliday) son la iniciación en roturas bicatenarias, digestión con nucleasa del dúplex agresor, nueva síntesis y reparación de huecos. Sin embargo, se conservan el cruce Holliday fundamental, la migración de ramas y la resolución, aunque con una complejidad algo mayor debido al número adicional de cruces Holliday. Aunque muchos aspectos del mecanismo de recombinación difieren

Los pasos en el modelo de doble hebra y rotura hasta la formación de las moléculas de articulación se esquematizan en la Figura 8.9.

1. Una endonucleasa escinde ambas cadenas de uno de los dúplex de ADN homólogos, que se muestran como finas líneas azules en la Figura 8.9. Este es el dúplex agresor, ya que inicia la recombinación. También es el receptor de información genética, como será evidente a medida que avancemos por el modelo.
2. El corte es agrandado por una exonucleasa para generar un hueco con extremos 3' monocatenarios en las hebras.
3. Uno de los extremos 3' libres invade una región homóloga en el otro dúplex (mostrado como líneas rojas gruesas), llamado dúplex donante. La formación de heterodúplex también genera un bucle D (un bucle de desplazamiento), en el que se desplaza una hebra del dúplex donante.
4. El bucle D se extiende como resultado de la síntesis reparadora cebada por el extremo 3' invasor. El bucle D finalmente se vuelve lo suficientemente grande como para cubrir todo el hueco en el dúplex agresor, es decir, el inicialmente escindido por la endonucleasa. El ADN recién sintetizado utiliza el ADN del dúplex de ADN invadido (línea roja gruesa) como molde, por lo que el nuevo ADN tiene la secuencia especificada por el ADN invadido.
5. Cuando la hebra desplazada del donante (rojo) se extiende hasta el otro lado del hueco en el receptor (azul delgado), se recocerá con el otro extremo 3' monocatenario en ese extremo del hueco. La hebra desplazada ahora ha llenado el hueco en el dúplex agresor, donando su secuencia al dúplex que inicialmente se escindió. La síntesis reparadora catalizada por la ADN polimerasa convierte el bucle D donante en ADN dúplex. Durante los pasos 4 y 5, el dúplex que inicialmente fue invadido sirve como dúplex donante; es decir, proporciona información genética durante esta fase de síntesis reparadora. Por el contrario, el dúplex agresor es el receptor de información genética. Tenga en cuenta que los modelos de invasión monocatenaria predicen lo contrario, donde la hebra invasora inicial es el donante de la información genética.
6. La ADN ligasa sellará las mellas, una en el lado izquierdo del diagrama en la Figura 8.9 y la otra en el lado derecho. Aunque este último se encuentra entre una hebra en el dúplex inferior y una hebra en el dúplex superior, es equivalente a la ligadura en la primera mella (la separación física aparente es un artefacto del dibujo). En ambos casos, el sellado de la mella forma una unión Holliday.

Figura 8.9. Pasos en el modelo de doble hebra para recombinación, desde el inicio hasta la formación de las articulaciones recombinantes.

En este punto, el intermedio de recombinación tiene dos articulaciones recombinantes (uniones Holliday). La brecha original en el dúplex agresor se ha llenado con ADN donado por el dúplex invadido. El hueco lleno ahora está flanqueado por heterodúplex. Los heterodúplex están dispuestos asimétricamente, con uno a la izquierda del hueco llenado en el dúplex agresor y uno a la derecha del hueco llenado en el dúplex donante. La migración de ramas puede extender las regiones de heterodúplex de cada unión Holliday.

Ahora se puede resolver el intermedio de recombinación. La presencia de dos juntas de recombinación agrega cierta complejidad, pero el proceso es esencialmente el mismo que se discutió para el modelo Holliday. Cada junta se puede resolver horizontal o verticalmente. El factor clave es si las articulaciones se resuelven en el mismo modo o sentido (ambos horizontalmente o ambos verticalmente) o en diferentes modos.

Si ambas articulaciones se resuelven con el mismo sentido (Figura 8.10), se liberarán los dúplex originales, cada uno con una región de información genética alterada que es una “huella” del evento de intercambio. Esa región de información alterada es la brecha original, más o menos las regiones cubiertas por la migración de ramas. Por ejemplo, si ambas juntas se resuelven cortando los hilos originalmente cortados (“horizontalmente” en nuestro diagrama del modelo Holliday), entonces no tienes cruce en ninguna de las juntas. Si ambas juntas se resuelven escindiendo los hilos no cortados originalmente (“verticalmente” en nuestro diagrama del modelo Holliday), entonces tienes un crossover en ambas juntas. Este cruce doble estrechamente espaciado no producirá recombinación de marcadores flanqueantes.

Figura 8.10. Resolución de intermedios en el modelo de doble hebra cortando las articulaciones recombinantes en el mismo modo o sentido. El cuadro describe la región entre los dos cruces resueltos.

En contraste, si cada articulación se resuelve en direcciones opuestas (Figura 8.11), entonces habrá recombinación entre marcadores flanqueantes. Es decir, una articulación no dará un crossover y la otra lo hará.

Figura 8.11.Resolución de intermedios en el modelo de rotura de doble hebra mediante el corte de las articulaciones recombinantes en el modo o sentido opuesto.

Varias características distinguen el modelo de rotura de doble hebra del modelo de mella monocatenaria propuesto inicialmente por Holliday. En el modelo de rotura de doble cadena, la región correspondiente al hueco original ahora tiene la secuencia del dúplex donante en ambas moléculas. Este está flanqueado por heterodúplex en cada extremo, uno en cada dúplex. Por lo tanto, la disposición del heterodúplex es asimétrica; es decir, hay un heterodúplex diferente en cada molécula dúplex. Parte de una molécula dúplex se ha convertido en la secuencia de la otra (el receptor, el dúplex de inicio se ha convertido en la secuencia del donante). En el modelo de invasión monocatenaria, cada dúplex de ADN tiene material heterodúplex que cubre la región desde el sitio inicial de intercambio hasta la rama migratoria, es decir, los heterodúplex son simétricos. En variaciones del modelo (Meselson-Radding) en el que algún ADN se degrada y re-sintetiza, el cromosoma iniciador es el donante de la información genética.

Estos modelos también tienen muchas características importantes en común. Los pasos que son comunes a todos los modelos incluyen la generación de una sola cadena de ADN en un extremo, una búsqueda de homología, invasión de cadenas o intercambio de cadenas para formar una molécula conjunta, migración de ramas y resolución. Las enzimas que catalizan cada una de estas etapas han sido aisladas y caracterizadas. Este es el tema del resto de este capítulo.

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