Bacteriófagos

Los bacteriófagos son virus que infectan a las bacterias. Debido a su gran número de progenie y capacidad para recombinarse en infecciones mixtas (más de una cepa de bacterias en una infección), se han utilizado ampliamente en la definición de genes de alta resolución. Gran parte de lo que sabemos sobre la estructura genética fina, previo al advenimiento de las técnicas de aislamiento y secuenciación de genes, derivan de estudios de forma en bacteriófagos.

Los bacteriófagos han sido un poderoso sistema genético modelo, porque tienen genomas pequeños, tienen un ciclo de vida corto y producen mucha progenie a partir de una célula infectada. Proporcionan un medio muy eficiente para la transferencia de ADN dentro o entre las células. El gran número de progenie permite medir eventos de recombinación muy raros.

Los bacteriófagos líticos forman placas en el césped de bacterias; estas son regiones de aclaramiento donde las bacterias infectadas se han lisado. Los primeros trabajos se centraron en mutantes con diferente morfología de placa, por ejemplo T2 r, que muestra lisis rápida y genera placas más grandes, o en mutantes con diferente rango de hospedadores, por ejemplo T2 h, que matarán tanto las cepas hospedadoras B como B/2.

Una prueba de complementación cis-trans define un cistrón, que es un gen

Seymour Benzer utilizó el locus r II del fago T4 para definir genes en virtud de su comportamiento en una prueba de complementación, y también para proporcionar una visión fundamental de la estructura de los genes (en particular, la disposición de los sitios mutables - ver la siguiente sección). La diferencia en la morfología de la placa entre los fagos r y r+ es fácil de ver (grande versus pequeño, respectivamente), y Benzer aisló muchos mutantes r del fago T4. El tipo silvestre, pero no ningún mutante de RII, crecerá en la cepa de E. coli K12 (l), mientras que tanto el fago de tipo silvestre como el mutante crecen igualmente bien en la cepa B. Por lo tanto, el fenotipo silvestre se detecta fácilmente por su capacidad para crecer en la cepa K12 (l).

Si la cepa de E. coli K12 (l) está coinfectada con 2 fagos portadores de mutaciones en diferentes posiciones en RIIa, no se obtiene multiplicación del fago (excepto los extremadamente raros recombinantes de tipo silvestre, que ocurren aproximadamente en 1 de cada 106 progenie). En el siguiente diagrama, cada línea representa el cromosoma de uno de los fagos parentales.

RIIa RIIb

fago 1 _|__x______|________|_

fago 2 _|_______x_|________|_

De igual manera, si los dos fagos en la coinfección portan mutaciones en diferentes posiciones en RIIb, no se obtiene multiplicación del fago (excepto los extremadamente raros recombinantes de tipo silvestre, aproximadamente 1 de cada 106).

RIIa RIIb

fago 3 _|_________|_x______|_

fago 4 _|_________|______x_|_

Sin embargo, si uno de los fagos coinfectantes porta una mutación en RIIa y el otro una mutación en RIIb, entonces se ve multiplicación del fago, formando un número muy grande de placas en la cepa K12 (l) de E. coli.

RIIa RIIb

fago 1 _|__x______|________|_ Proporciona proteína wt RIIb

fago 4 _|_________|______x_|_ Proporciona proteína RIIa wt

Juntos, estos dos fagos proporcionan todas las funciones del fago, se complementan entre sí. Esta es una prueba de complementación positiva. Los dos primeros ejemplos no muestran complementación, y los colocamos en el mismo grupo de complementación. Los mutantes que no complementan se colocan en el mismo grupo de complementación; son diferentes alelos mutantes del mismo gen. Benzer demostró que había dos grupos de complementación (y por lo tanto dos genes) en el locus r II, al que llamó A y B.

Ejercicio 1.3

En la infección mixta con fago 1 y fago 4, también se obtienen los raros recombinantes de tipo silvestre, pero hay más recombinantes que los que se ven en las coinfecciones con diferentes alelos mutantes. ¿Por qué?

Los experimentos de Benzer analizando el locus RII del bacteriófago T4 formalizaron la idea de una prueba de complementación cis‑trans para definir un cistrón, que es una definición operativa de un gen. Primero, definamos cis y trans cuando se usan para referirse a genes. En la configuración cis, ambas mutaciones están en el mismo cromosoma. En la configuración trans, cada mutación está en un cromosoma diferente

Las mutaciones en el mismo gen no se complementarán en trans, mientras que las mutaciones en diferentes genes se complementarán en trans (Figura 1.12). En la configuración cis, el otro cromosoma es de tipo salvaje, y el tipo silvestre complementará cualquier mutación recesiva. El grupo de complementación corresponde a una entidad genética que llamamos cistrón, es equivalente a un gen.

Esta prueba requiere una situación diploide. Esto puede ser un diploide natural (2 copias de cada cromosoma) o un parcial, o merodiploide, por ejemplo, conjugando con una célula que porta un factor F'. Algunos bacteriófagos portan trozos del cromosoma huésped; estos se denominan fagos transductores. La infección de E. coli con un fago transportador de una mutación en un gen huésped es otra forma de crear un merodiploide en el laboratorio para el análisis de complementación.

Figura 1.12. La prueba de complementación define el cistrón y distingue entre dos genes.

La recombinación dentro de genes permite la construcción de un mapa lineal de sitios mutables que constituyen un gen

Una vez que el análisis de recombinación dejó claro que los cromosomas eran matrices lineales de genes, estos fueron considerados como “cadena de perlas” con los genes, o “perlas”, separados por algún material no genético (Figura 1.13). Se pensó que este material no genético putativo era el sitio de recombinación, mientras que los genes, las unidades de herencia, se pensó que eran resistentes a la recombinación. Sin embargo, al examinar el gran número de progenie de infecciones por bacteriófagos, se puede demostrar que la recombinación puede ocurrir dentro de un gen. Esto soporta el segundo modelo mostrado en la Figura 1.13. Debido al apretado empaquetamiento de las regiones codificantes en los genomas de fagos, la recombinación casi siempre ocurre dentro de genes en bacteriófagos, pero en genomas con considerables regiones no codificantes entre genes, la recombinación también puede ocurrir entre genes.

Figura 1.13.Modelos para genes como unidades mutables discretas separadas por material no genético (arriba) o como parte de un material genético continuo (abajo).

Las pruebas entre estos dos modelos requirieron el cribado de marcadores genéticos (mutaciones) que están muy cerca uno del otro. Cuando dos marcadores están muy cerca uno del otro, la frecuencia de recombinación es extremadamente baja, por lo que se tiene que examinar suficiente progenie para resolver distancias de mapa de, digamos 0.02 CentimOrgans = 0.02 unidades de mapa = 0.02% recombinantes. Esto significa que 2 de cada 10,000 progenie mostrarán recombinación entre dos marcadores que están separados por 0.02 unidades de mapa, y obviamente uno tiene que examinar al menos 10,000 progenie para puntuar de manera confiable esta recombinación. Ese es el poder de la genética microbiana, en realidad se puede seleccionar o examinar a través de esta gran progenie, a veces con bastante facilidad.

Un ejemplo de recombinación en fagos se muestra en la Figura 1.14. El fago T2 de tipo silvestre forma pequeñas placas y mata solo la cepa B. Por lo tanto, diferentes alelos de h se pueden distinguir sembrando en placas sobre una mezcla de cepas B y B/2 de E. coli. El fago portador del alelo h mutante generará placas claras, ya que matan ambas cepas. Los fagos con el tipo salvaje h + dan placas turbias, ya que las células B/2 no se lisan sino que las células B sí. Cuando se coinfecta una mezcla de cepas de E. coli B y B/2 con T2 hr y T2 h+r+, se obtienen cuatro tipos de placas. La mayoría tienen los fenotipos parentales, claros y grandes o turbios y pequeños. Estas placas contienen fagos de progenie que retienen los genotipos parentales T2 hr y T2 h+r+, respectivamente. Los otros dos fenotipos son no parentales, es decir, claros y pequeños o turbios y grandes. Estos son de progenie con genotipos recombinantes, es decir T2 hr+ y T2 h+r. En esta infección mixta, se produjo recombinación entre dos genomas de fagos en una misma célula.

Figura 1.14. Recombinación en bacteriófagos

La primera demostración de recombinación dentro de un gen provino del trabajo en los genes RIIa y RIIb del fago T4. Estos experimentos de Seymour Benzer, publicados en 1955, utilizaron técnicas como la diagramada en la Figura 1.14. Recuerde que las mutaciones en el gen r provocan una lisis rápida de las células infectadas, es decir, la duración del ciclo lítico es más corta. La diferencia en la morfología de la placa entre los fagos r y r+ es fácil de ver (grande versus pequeño, respectivamente). Estos dos genes están muy unidos entre sí, y muchas mutaciones se aislaron de forma independiente en cada uno. Esto se resumió en la discusión sobre la complementación anterior.

Considerar los resultados de infección de un cultivo bacteriano con dos alelos mutantes del gen RIIa.

T4 RIIa6 _|_______________________x______|_

y T4 RIIa27 _|_______x______________________|_

(x marca la posición de la mutación en cada alelo).

Los fagos de progenie de esta infección incluyen aquellos con un genotipo parental (en la gran mayoría), y con una frecuencia mucho menor, dos tipos de recombinantes:

tipo salvaje T4 r+ _|______________________________|_

mutante doble T4 RIIA6 RIIA27 _|_______x_______________x______|_

El tipo salvaje se puntuará fácilmente porque, y no ningún mutante de RII, crecerá en la cepa de E. coli K12 (l), mientras que tanto el fago de tipo silvestre como el mutante crecen igualmente bien en la cepa B. De esta manera se puede seleccionar para el tipo silvestre (y verá solo el recombinante deseado). Encontrar los mutantes dobles es más laborioso, ya que se obtienen únicamente mediante el cribado a través de la progenie, probando fagos que cuando se retrocruzan con el fago parental no dan como resultado progenie recombinante de tipo silvestre.

Se obtuvieron números iguales de recombinantes de tipo silvestre y de doble mutante, demostrando que la recombinación puede ocurrir dentro de un gen, y que esto ocurre por cruce recíproco. Si la recombinación fuera solo entre genes, entonces no resultaría ningún fago de tipo silvestre. Se obtuvo un amplio espectro de valores de recombinación en cruces para diferentes alelos, al igual que se obtiene para cruces entre mutantes en genes separados.

Como resultado de estos experimentos de recombinación dentro de los genes rII podrían hacerse varias conclusiones importantes.

1. Un gran número de sitios mutables ocurren dentro de un gen, excediendo unos 500 para los genes RIIa y RIIb. Ahora nos damos cuenta de que estos corresponden a los pares de bases individuales dentro del gen.
2. Los mapas genéticos son claramente lineales, lo que indica que el gen es lineal. Ahora sabemos que un gen es un polímero lineal de nucleótidos.
3. La mayoría de las mutaciones son cambios en un sitio mutable (mutaciones puntuales). Muchos genes pueden ser restaurados a tipo salvaje sometiéndose a una mutación inversa en el mismo sitio (reversión).
4. Otras mutaciones provocan la deleción de uno o más sitios mutables, reflejando una pérdida física de parte del gen rII. Las eliminaciones de uno o más sitios mutables (par de bases) son extremadamente improbables que vuelvan al tipo salvaje original.

Un gen codifica un polipéptido

Una de las ideas fundamentales sobre cómo funcionan los genes es que un gen codifica una enzima (o más precisamente, un polipéptido). Beadle y Tatum llegaron a esta conclusión con base en su análisis de complementación de los genes requeridos para la biosíntesis de arginina en hongos. Mostraron que una mutación en cada gen condujo a una pérdida de actividad de una enzima en la vía multietapa de la biosíntesis de arginina. Como se discutió anteriormente en la sección sobre disección genética, se aislaron un gran número de auxótrofos Arg (que requieren Arg para el crecimiento), y luego se organizaron en un conjunto de grupos de complementación, donde cada grupo de complementación representa un gen.

El trabajo clásico de Beadle y Tatum demostró una relación directa entre los genes definidos por los mutantes auxotróficos y las enzimas requeridas para la biosíntesis de Arg. Mostraron que una mutación en un gen resultó en la pérdida de una actividad enzimática particular, por ejemplo, en el esquema generalizado a continuación, una mutación en el gen 2 condujo a una pérdida de actividad de la enzima 2. Esto condujo a una acumulación del sustrato para esa reacción (N intermedio en el diagrama a continuación). Si hubo 4 grupos de complementación para los auxótrofos Arg, es decir, 4 genes, entonces se encontraron 4 enzimas en la vía para la biosíntesis de Arg. Cada enzima fue afectada por mutaciones en uno de los grupos de complementación.

Intermedios:

M® N® O® P® Arg

enzima 1 enzima 2 enzima 3 enzima 4

gen 1 gen 2 gen 3 gen 4

Figura 1.15. Un esquema general que muestra las relaciones entre los intermedios metabólicos (M, N, O, P), y el producto final (Arg), las enzimas y los genes que los codifican.

En general, cada etapa en una vía metabólica es catalizada por una enzima (identificada bioquímicamente) que es el producto de un gen particular (identificado por mutantes incapaces de sintetizar el producto final, o incapaces de descomponer el compuesto de partida, de una ruta). El número de genes que pueden generar mutantes auxotróficos es (generalmente) el mismo que el número de etapas enzimáticas en la ruta. A los mutantes auxotróficos en un gen dado les falta la enzima correspondiente. Así, Beadle y Tatum concluyeron que un gen codifica una enzima. A veces se requiere más de un gen para codificar una enzima porque la enzima tiene múltiples subunidades polipeptídicas diferentes. Así, cada polipéptido es codificado por un gen.

Los intermedios metabólicos que se acumulan en cada mutante pueden ser utilizados para colocar las enzimas en su orden de acción en una vía. En el diagrama de la Figura 1.15, los mutantes en el gen 3 acumularon la sustancia O. Alimentando la sustancia O a mutantes en el gen 1 o en el gen 2 permite el crecimiento en ausencia de Arg. Se concluye que los defectos en la enzima 1 o la enzima 2, respectivamente, están aguas arriba de la enzima 3. En contraste, alimentar la sustancia O a mutantes en el gen 4 no permitirá el crecimiento en ausencia de Arg. A pesar de que este mutante puede convertir la sustancia O en sustancia P, no tiene una enzima activa 4 para convertir P en Arg. La incapacidad de los mutantes en el gen 4 para crecer sobre la sustancia O muestra que la enzima 4 está aguas abajo de la enzima 3.

Ejercicio 1.4

Imagina que estás estudiando la biosíntesis de serina en un hongo. Aíslas auxótrofos de serina, haces todos los cruces por parejas de los mutantes y descubres que los auxótrofos pueden agruparse en tres grupos de complementación, llamados A, B y C. También descubres que un intermedio metabólico diferente se acumula en miembros de cada grupo de complementación - sustancia A en auxótrofos en el grupo de complementación A, sustancia B en el grupo de complementación B y sustancia C en el grupo de complementación C. Cada uno de los intermedios se alimenta a auxótrofos de cada uno de los tres grupos de complementación como se tabula a continuación. A + significa que el auxótrofo pudo crecer en medio en ausencia de serina cuando se alimentó con la sustancia indicada; a - denota no crecimiento en ausencia de serina.

Fed:	mutante en el grupo de complementación A	mutante en el grupo de complementación B	mutante en el grupo de complementación C
sustancia A	-	+	+
sustancia B	-	-	-
sustancia C	-	+	-

En la vía biosintética a la serina en este hongo, ¿cuál es el orden de las enzimas codificadas en los tres grupos de complementación? La enzima A es codificada por el gen que cuando se altera genera mutantes que caen dentro del grupo de complementación A, etc.

El gen y su producto polipeptídico son colineales

Una vez que se determinó que un gen era una matriz lineal de sitios mutables, que los genes están compuestos por una cadena de nucleótidos llamada ADN (ver Capítulo 2), y que cada gen codificaba un polipéptido, quedaba por determinar cómo exactamente esa cadena de nucleótidos codificaba para una secuencia de aminoácidos particular. Este problema se estudió a lo largo de varias avenidas, culminando en un logro importante de la última mitad del ^siglo XX: el desciframiento del código genético. La asignación detallada de codones particulares (tripletes de nucleótidos adyacentes) se discutirá en el Capítulo 13. En las próximas secciones de este capítulo, examinaremos cómo se descifraron algunas de las características básicas del código genético.

A priori, las unidades codificantes dentro de un gen podrían codificar tanto la composición como la dirección para cada aminoácido, como se ilustra en el Modelo 1 de la Figura 1.17. En este modelo, las unidades codificantes podrían ser mezcladas y aún así especificar la misma proteína. En tal situación, el polipéptido no sería colineal con el gen.

Figura 1.16.Modelos alternativos para la estructura de genes y codones.

En un modelo alternativo (Modelo 2 en la Figura 1.16), las unidades codificantes solo especifican la composición, pero no la posición, de un aminoácido. La “dirección” del aminoácido se deriva de la posición de la unidad codificadora dentro del gen. Este modelo predeciría que el gen y su producto polipeptídico serían colineales, por ejemplo, la mutación en la 5ª unidad codificadora afectaría al 5º aminoácido de la proteína, etc.

Charles Yanofsky y sus compañeros de trabajo (1964) probaron estos dos modelos y determinaron que el gen y el producto polipeptídico son efectivamente colineales. Utilizaron frecuencias de recombinación para mapear las posiciones de diferentes alelos mutantes en el gen que codifica una subunidad particular de la enzima triptófano sintasa. Luego determinaron la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de tipo silvestre y mutantes. Como se ilustra en la Figura 1.17, la posición de un alelo mutante en el mapa de recombinación del gen corresponde con la posición del aminoácido alterado en el producto polipeptídico mutante. Por ejemplo, el alelo A101 mapea a un extremo del gen, y el reemplazo de Glu® Val correspondiente está cerca del extremo N del polipéptido. El alelo A64 mapea cerca del otro extremo del gen, y el reemplazo de Ser® Leu correspondiente está cerca del extremo C del polipéptido. Esta correspondencia entre las posiciones de las mutaciones en cada alelo y las posiciones de los cambios consiguientes en el polipéptido muestran que el Modelo 1 puede ser eliminado y el Modelo 2 está soportado.

Figura 1.17.El polipéptido es colineal con el gen.

Los sitios mutables son pares de bases a lo largo de la doble hélice

El gran número de sitios mutables que se encuentran en cada gen, y entre los cuales se puede producir la recombinación, lleva a concluir que los sitios mutables son pares de bases a lo largo del ADN. La determinación de la secuencia de los genes de tipo silvestre y mutante confirma esta conclusión.

Los aminoácidos individuales se especifican por tres nucleótidos adyacentes, que son codones a

Esta conclusión requiere tres piezas de información.

En primer lugar, los sitios mutables adyacentes especifican aminoácidos. Llegar a esta conclusión requirió investigar la estructura fina de un gen, incluyendo la rara recombinación entre mutaciones muy estrechamente vinculadas dentro de un gen. Yanofsky y sus colegas, trabajando con mutaciones el gen trpA de E. coli, que codifica la triptófano sintasa, mostraron que diferentes alelos mutados en un mismo codón podrían recombinarse (aunque a muy baja frecuencia). (Este es el mismo laboratorio y el mismo sistema que se utilizó para demostrar que un gen y su producto polipeptídico son colineales). Así, la recombinación entre dos alelos diferentes puede ocurrir dentro de un codón, lo que significa que un codón debe tener más de un sitio mutable. Ahora reconocemos que un sitio mutable es un nucleótido en el ADN. Así, los sitios mutables adyacentes (nucleótidos) codifican un solo aminoácido.

Veamos esto con más detalle (Figura 1.18). Yanofsky y sus colegas examinaron dos alelos mutantes diferentes de TrpA, cada uno de los cuales causó alteración en el aminoácido 211 de la triptófano sintasa. En el alelo mutante A23, Gly de tipo silvestre se convierte en Arg mutante. En el alelo mutante A46, Gly de tipo silvestre se convierte en Glu mutante.

G GA (Gly 211) —> A GA (Arg 211) alelo mutante A23

G G A (Gly 211) —> G A (Glu 211) alelo mutante A46

A23 'A46 A GA' G A A® GGA (Gly de tipo silvestre 211 en 2 de 100,000 progenie)

Figura 1.18. La recombinación puede ocurrir entre dos alelos mutantes que afectan al mismo codón.

Los alelos A23 y A46 no son formas alternativas del mismo sitio mutable, debido a que la recombinación para producir el tipo salvaje ocurre, aunque a una frecuencia muy baja (0.002%; los sitios están muy próximos entre sí, ¡de hecho en el mismo codón!). Si involucraran el mismo sitio mutable, nunca se vería el recombinante de tipo silvestre.

La segunda observación es que el código genético no se superpone. Esto se demostró demostrando que una mutación en un solo sitio altera solo un aminoácido. Esto entra en conflicto con las predicciones de un código superpuesto (ver Figura 1.19), y por lo tanto el código debe ser no superpuesto.

Figura 1.19. Predicciones de los efectos de las sustituciones, inserciones o deleciones de nucleótidos en polipéptidos codificados por un código superpuesto, puntuado o no solapado, no puntuado.

La tercera observación es que el código genético se lee en trillizos desde un punto de partida fijo. Esto se demostró al examinar el efecto de las mutaciones de desplazamiento del marco de lectura. Como se muestra en la Figura 1.19, un código que carece de puntuación tiene un cierto marco de lectura. Se prevé que las inserciones o deleciones de nucleótidos tengan un efecto drástico sobre la proteína codificada porque cambiarán ese marco de lectura. El hecho de que esto se observó fue una de las principales razones para concluir que las moléculas de ARNm codificadas por genes se leen en bloques sucesivos de tres nucleótidos en un marco de lectura particular.

Para la secuencia mostrada en la Figura 1.20, la inserción de una A desplaza el marco de lectura, por lo que todos los aminoácidos después de la inserción difieren de la secuencia de tipo silvestre. (El 4º aminoácido sigue siendo un Gly debido a la degeneración en el código: tanto GGC como GGG codifican para Gly.) De manera similar, la deleción de una U altera la secuencia completa después de la deleción.

Figura 1.20. Las mutaciones de desplazamiento de marco muestran que el código genético se lee en trillizos.

Estas observaciones muestran que la secuencia de nucleótidos se lee, o traduce, desde un punto de partida fijo sin puntuación. Un modelo alternativo es que el grupo de nucleótidos que codifican un aminoácido (el codón) también podría incluir una señal para el extremo del codón (Modelo 2 en la Figura 1.19). Esto podría considerarse una “coma” al final de cada codón. Si ese fuera el caso, las inserciones o deleciones sólo afectarían al codón en el que ocurren. Sin embargo, los datos muestran que todos los codones, incluyendo y después del que contiene la inserción o deleción, están alterados. Así, el código genético no está puntuado, sino que se lee en un marco particular que se define por un punto de partida fijo (Modelo 3 en la Figura 1.19). Ese punto de partida es un AUG particular, que codifica metionina. (Más sobre esto se cubrirá en el Capítulo 13).

Los resultados de las mutaciones de cambio de marco son tan drásticos que las proteínas generalmente no son funcionales. Por lo tanto, una selección o selección de mutantes con pérdida de función frecuentemente revela estos mutantes de desplazamiento de marco. Las sustituciones de nucleótidos simples que conducen a reemplazos de aminoácidos a menudo tienen muy poco efecto sobre la proteína y, por lo tanto, tienen poco, o sutiles, fenotipos.

Un mutante doble generado por el cruce entre la inserción (+) y la deleción (‑) da como resultado un fenotipo (casi) normal, es decir, reversión de inserción o deleción.

Un gen que contiene tres inserciones (o deleciones) estrechamente espaciadas de nucleótidos individuales producirá un producto funcional. Sin embargo, cuatro o cinco inserciones o deleciones no dan un producto funcional (Crick, Barnett, Brenner y Watts-Tobin, 1961). Esto proporcionó la mejor evidencia de que el código genético se lee en grupos de tres nucleótidos (no dos o cuatro). En los siguientes 5 años se trabajó el código (en 1966) y esta inferencia se confirmó definitivamente.

Colaboradores y Atribuciones

• Template:ContribHardison