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3.9: Laboratorio 2. Esterilización y preparación de medios de cultivo

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    Objetivos

    • Preparar y esterilizar material de uso común en el laboratorio microbiológico.
    • Aprender el manejo de aparatos más comúnmente utilizados en el laboratorio de microbiología.
    • Diseñar, elaborar y esterilizar medios de cultivo.

    Desarrollo práctico

    Primer día:

    a) Preparación de material para esterilizar y elección del método de esterilización adecuado.

    Complete la siguiente tabla:

    MATERIAL

    METODO

    CONDICIONES

    Antibióticos (en solución y sólido)

    Caja de cirugía

    Equipo de filtración (presión

    positiva y negativa)

    Filtros esterilizantes

    Glicerol al 15%

    Granos de cereales

    Guantes de goma

    Jeringas de plástico

    Jeringas de vidrio

    Microtubos (tipo tubos

    Eppendorff)

    Pipetas en pipeteros

    Pipetas envueltas en papel

    Placas de Petri (de vidrio y

    plásticas)

    Puntas para micropipetas

    Solución de azúcar al 40%

    Tapones de goma

    Tierra

    Vaselina

    Vitaminas (en solución y sólida)

    b) Aprendizaje del manejo y cuidado de aparatos más comúnmente utilizados en un laboratorio microbiológico.

    • Heladeras (2 a 4°C y congeladores hasta –80°C).
    • Cabina de flujo laminar y cabina de seguridad biológica.
    • Autoclave.
    • Estufas de incubación (28 – 37° C) y estufas de esterilización.
    • Homogeneizador de muestras.
    • Centrífugas y ultracentrífugas.
    • Balanzas de diferente precisión (0,1 g, 0,001g), analíticas y digitales.
    • pH-metros.
    • Microscopios de campo brillante.
    • Liofilizador.

    c) Preparación de medios de cultivo:

    Cada subgrupo preparará diferentes medios de cultivos: agar nutritivo, agar manitol salado, agar cetrimide, Agar eosina-azul de metileno (EMB).

    Consideraciones generales:

    • Leer atentamente la fórmula de los medios y calcular la cantidad de cada uno de los componentes químicos.
    • Pesar en balanza digital sobre papel aluminio.
    • Colocar los componentes en un frasco Erlenmeyer de volumen adecuado y agregar el agua destilada.
    • Medir el pH.
    • Agregar agar en caso de los medios sólidos.
    • Acondicionar para su esterilización en el autoclave.
    • Conservar en heladera a 4º C hasta su fraccionamiento.

    Agar nutritivo

    Extracto de carne

    3 g

    Peptona

    5 g

    NaCl

    8 g

    Agar

    15 g

    Agua destilada

    1000 ml

    pH 7.3

    Parte del medio de cultivo se esterilizará por autoclave para luego ser fraccionado en placas de Petri estériles y parte, se disolverá por calentamiento a baño de María, se distribuirá en tubos y se esterilizarán por autoclave. Luego del proceso de esterilización, los tubos se inclinarán a fin de obtener tubos en “agar pico de flauta” y tubos con “agar inclinado”.

    Medio de manitol saladO (medio de Chapman)

    Extracto de carne

    1 g

    Polipeptona

    10 g

    ClNa

    75 g

    Manitol

    10 g

    Rojo fenol

    0,025 g

    Agar

    15 g

    Agua destilada

    1000 ml

    Este medio es altamente selectivo para el aislamiento y diferenciación de especies del género Staphylococcus que son patógenas y pone de manifiesto la habilidad de S. aureus de fermentar el manitol. Es selectivo debido a la concentración de ClNa (7,5%, aproximadamente 10 veces más que un medio común), esta concentración elevada de sal inhibe la mayoría de los microorganismos que no pertenecen al género Staphylococcus. El agregado de manitol lo hace al medio diferencial, la utilización de éste azúcar determina la producción de ácido dando como resultado colonias opacas rodeadas de una zona amarilla como consecuencia del viraje del indicador (rojo fenol) de rosa al color amarillo. Esta característica se manifiesta cuando en el medio se desarrolla la especie patógena S. aureus. Cuando no se produce la utilización de éste azúcar se produce la alcalinización del medio, con viraje del indicador de rosa a fucsia. Esta reacción es característica de la especie no patógena S. epidermidis

    Medio emb (medio de Levine)

    Peptona

    10 g

    Lactosa

    10 g

    Fosfato dipotásico

    2 g

    Eosina

    0,4 g

    Azul de Metileno

    0,065 g

    Agar

    15 g

    Agua destilada

    1000 ml

    pH 7.3

    Es un medio selectivo y diferencial recomendado para el aislamiento de bacilos Gram (-) entéricos. El azul de metileno y la eosina inhiben a las bacterias Gram (+) y Gram (-) exigentes, esta característica lo hace selectivo. El agregado de lactosa lo hace diferencial, las bacterias entéricas producen un descenso de pH que da como resultado colonias rojas (lac+). El descenso de pH producido por E. coli hace que se forme una unión amida entre la eosina y el azul de metileno dando como resultado colonias con brillo metálico (lac +).

    Agar cetrimide

    Peptona de gelatina

    20 g

    SO4K2

    10 g

    Cl2Mg

    1,4 g

    Cetrimide

    0,3 g

    Agar

    13,6 g

    Agua destilada

    1000 ml

    Aditivo: glicerina

    10 ml

    Es un medio selectivo para aislamiento de especies de Pseudomonas a partir de diversos materiales. Posee en su composición Cetrimide (Bromuro de cetiltrimetil amonio) un detergente que provoca una notable inhibición de toda biota acompañante. En este medio también se pone de manifiesto la producción de pigmentos por algunas especies, tales como, Pseudomonas aeruginosa.

    Segundo día

    a) Fraccionamiento de los medios de cultivos en placa

    Una vez esterilizados los diferentes medios de cultivos y antes que solidifiquen se vierten en placas estériles (10 – 20 ml) en cabina de seguridad biológica. Una vez solidificado, se llevan las placas a la estufa de 37º C unos minutos, colocándolas invertidas y destapadas para que se evapore el agua de condensación. Luego se tapan y están listas para ser usadas. Si no se usan en el momento deben ser conservadas a 4º C.

    b) Fraccionamiento del agar nutritivo en tubos

    Se coloca el agar nutritivo fundido en tubos (1/3 del volumen), se esterilizan y luego se dejan solidificar: a) en forma vertical para obtener agar en columna; b) con una mayor inclinación para agar inclinado; c) y con una menor inclinación para obtener el agar pico de flauta.

    c) Discusión teórica de los criterios a tener en cuenta para la selección de un método de esterilización adecuado.

    Tratamiento de los materiales usados

    • Una vez finalizado el trabajo de laboratorio, limpie adecuadamente las mesadas de trabajo con alcohol al 70% o hipoclorito de sodio al 1%.
    • Descarte todo material contaminado en las bolsas para residuos patógenos.
    • Lávese las manos con jabón.